小克銀漢霉發(fā)酵產(chǎn)亞麻酸的研究

小克銀漢霉發(fā)酵產(chǎn)亞麻酸的研究

氨基丙烯酸（gla）是人體所必需的脂肪酸，也是人體合成前列腺素和三烯酸的前體。它直接參與了體內(nèi)一系列代謝和生物合成的過(guò)程,GLA的代謝異常會(huì)引起某些疾病發(fā)生。人體所需GLA可從食物中亞油酸轉(zhuǎn)化,但轉(zhuǎn)化率有限,足夠的GLA必須從外界獲取。目前,微生物發(fā)酵法獲取GLA是當(dāng)今研究主流,但目前研究的菌種主要集中在深黃被孢霉上,該菌種總脂含量高(50.2%),但總脂中GLA含量少(8.5%);而小克銀漢霉屬菌種總脂含量不高(40%),但總脂中GLA含量很高(>18%),但是目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該菌種的研究工作較少,僅有人對(duì)該屬菌種的固態(tài)發(fā)酵和接種情況做了一般性研究,但對(duì)于該屬菌種的液體發(fā)酵研究尚未見(jiàn)報(bào)道,本論文就此做了初步研究,旨在尋找一種更適合GLA生產(chǎn)的菌種,為把GLA作為醫(yī)藥產(chǎn)品推向市場(chǎng)奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)菌株雅致小克銀漢霉(Cunningnamellaelegans)C01,本研究組保藏。1.2培養(yǎng)條件和培訓(xùn)1.2.1斜培養(yǎng)基g.l馬鈴薯200,瓊脂15-20,葡萄糖20,98kPa下滅菌15min。1.2.2kh2po45kh2po45葡萄糖60,尿素6,(NH4)2SO45,酵母浸膏3,KH2PO45,MgSO41,生物素0.06mg/L,檸檬酸三鈉4,檸檬酸1,自然pH,裝液量100mL/500mL,78.4kPa下滅菌15min。1.2.3酸3,nh4no33葡萄糖100,MgSO40.3,KH2PO43,酵母浸膏3,檸檬酸三鈉12,檸檬酸3,NH4NO33,微量元素液:Fe(FeSO4)20mg,Ca(CaCl2)20mg,Cu(CuSO4)0.4mg,Zn(ZnSO4)2mg,自然pH,裝液量100mL/500mL,接種量10%,78.4kPa下滅菌15min。1.2.4細(xì)菌激活斜面接種后,經(jīng)28℃培養(yǎng)7d,將斜面培養(yǎng)物放置4℃下冰箱中保存。1.3干重測(cè)定發(fā)酵液用綢布過(guò)濾,所得濾餅用500mL水徹底清洗,將菌絲體在80℃烘箱中烘24h,干燥皿中冷卻,稱重。1.4子菌懸液取?18×180的斜面一支,刮下孢子加入到滅好菌的大試管內(nèi)(內(nèi)有10顆直徑5mL的小玻璃珠),加入20mL無(wú)菌水振蕩10h。1.5ph測(cè)量用精密pH試紙測(cè)定。1.6總脂測(cè)定1.7-亞麻酸法的測(cè)定色譜法,色譜條件見(jiàn)文獻(xiàn)。1.8脂肪測(cè)定2結(jié)果與討論2.1種子培養(yǎng)條件的確定2.1.1tween-80添加溫度對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響在不同溫度下,對(duì)比表面活性劑Tween-80的加入對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響,結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明加入Tween-802滴(相當(dāng)于0.2%)有利菌絲體生長(zhǎng),可能是因?yàn)楸砻婊钚詣┑募尤?降低了培養(yǎng)液的表面張力,使菌絲體容易分散,生長(zhǎng)微環(huán)境好,菌絲量大;另外,無(wú)論有無(wú)Tween-80加入,30℃時(shí)菌體生長(zhǎng)最好,溫度過(guò)高、過(guò)低均不利菌體生長(zhǎng)。說(shuō)明該菌體的最適生長(zhǎng)溫度為30℃。2.1.2最佳種子培養(yǎng)基配方的確定設(shè)計(jì)不同種子培養(yǎng)基配方,在同一條件下用搖瓶培養(yǎng),獲得最佳種子培養(yǎng)基配方組成見(jiàn)“材料與方法”中所述。固定搖床轉(zhuǎn)速為180r/min,通過(guò)改變培養(yǎng)搖瓶封口情況來(lái)獲得不同的通風(fēng)量,結(jié)果表明用8層紗布封口菌體生長(zhǎng)最好。2.1.3接種方法對(duì)菌株生長(zhǎng)和氧需量的影響種子培養(yǎng)基中加入0.2%Tween-80,對(duì)比不同的接種方法對(duì)種子生長(zhǎng)影響,結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)表明菌懸液(本實(shí)驗(yàn)暫定菌懸液量為1.0mL)接種生長(zhǎng)情況較好,可能是雅致小克銀漢霉作為霉菌,其菌絲較密,而對(duì)氧需量又大,只有通過(guò)菌懸液接種時(shí),才能使大量菌絲體分散,不致結(jié)團(tuán),從而使菌絲體的生長(zhǎng)微環(huán)境情況較好,氧不再是限制性生長(zhǎng)因子。2.1.4培養(yǎng)成培養(yǎng)液體培養(yǎng)基時(shí)密度對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)時(shí)間的菌絲體形狀,結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明48h種齡菌絲粗壯,菌絲頂端開(kāi)始膨大呈小球狀,可能是在產(chǎn)生孢子,溶液中有少數(shù)散落孢子,接于發(fā)酵搖瓶,培養(yǎng)4d后,所得菌絲干重量最大,為29.424g/L,說(shuō)明菌絲體移入到新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中,孢子發(fā)芽生成新菌絲體,而原有的菌絲也會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)。培養(yǎng)24h,時(shí)間太短,菌絲量少;培養(yǎng)72h,時(shí)間太長(zhǎng),菌絲體則部分自溶了。2.2發(fā)酵條件的確定2.2.1小克銀漢霉-亞麻酸發(fā)酵的研究對(duì)該菌種在相同培養(yǎng)時(shí)間分別進(jìn)行一級(jí)發(fā)酵和二級(jí)發(fā)酵,結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明二級(jí)發(fā)酵無(wú)論干重量還是總脂量(實(shí)驗(yàn)研究表明:菌體內(nèi)γ-亞麻酸占總脂比例只與菌種有關(guān),所以此處以總脂量代替γ-亞麻酸含量作為衡量標(biāo)準(zhǔn))都高于一級(jí)發(fā)酵,這是因?yàn)橹臼切】算y漢霉生長(zhǎng)到一定程度的積累產(chǎn)物,菌體生長(zhǎng)應(yīng)采用較高氮源,較低碳源且在較高溫的條件下;而脂肪酸的骨架需很多的碳原子,故積累脂肪的條件應(yīng)是較高碳源,較低氮源且在較低溫下。兩種不同的目的,要求又不相同,所以二級(jí)發(fā)酵法較好。2.2.2反應(yīng)溫度對(duì)菌體干重量和總脂量的影響采用不同溫度進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)4d,結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明25℃時(shí)菌體干重量(DC)和總脂量(TL)均達(dá)最高,分別為23.083和9.551g/L,這可能和酶的最適反應(yīng)溫度有關(guān),偏離這一最適溫度將不利菌體內(nèi)相應(yīng)的酶活性,進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)。2.2.3接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)和桿菌生長(zhǎng)的影響以48h的種子按不同接種量接入發(fā)酵瓶中,培養(yǎng)4d,結(jié)果見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)表明,接種量10%時(shí)最佳,DC和TL分別為24.719、11.400g/L,這是因?yàn)榻臃N量過(guò)大時(shí),菌絲互相纏繞,結(jié)團(tuán),菌絲體微環(huán)境惡劣,反而不利菌體產(chǎn)脂;接種量過(guò)低,則沒(méi)有足夠的生長(zhǎng)菌絲體。2.2.4干重量和總脂量在25℃,10%接種量下,觀察不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體生長(zhǎng)、生產(chǎn)情況,結(jié)果見(jiàn)圖5。實(shí)驗(yàn)表明,培養(yǎng)7d(168h)后干重量和總脂量均達(dá)最大,依次為35.735、15.980g/L。由圖5可知,該菌種的生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累是偶聯(lián)型,隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增大,但是有個(gè)最佳培養(yǎng)時(shí)間。2.2.5總脂含量的測(cè)定不同初始pH對(duì)菌體產(chǎn)油脂的影響見(jiàn)圖6。實(shí)驗(yàn)表明pH值在4.8,5.4時(shí)所得菌體干重量較大分別為23.586、23.721g/L;總脂含量也較高,分別為9.782、和10.195g/L,即pH值在4.8到5.4間是雅致小克銀漢霉最適pH。這是因?yàn)閜H值影響細(xì)胞表面帶電狀態(tài),從而影響菌絲體間聚集狀態(tài),此外,pH還會(huì)影響培養(yǎng)基中有機(jī)化合物的離子化狀態(tài),而多數(shù)非離子狀態(tài)化合物比起離子狀態(tài)化和物更容易滲入細(xì)胞,這樣意味著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在不同pH下有不同的進(jìn)入細(xì)胞難度,從而間接影響細(xì)胞生長(zhǎng)。2.2.6碳源濃度對(duì)碳源質(zhì)構(gòu)的影響,c/n確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n的確定,c/n以葡萄糖為碳源、以尿素為氮源,固定氮源濃度,通過(guò)改變碳源濃度改變C/N,結(jié)果見(jiàn)圖7。最適C/N為33∶1,即當(dāng)葡萄糖濃度為10%時(shí),菌體干重量和總脂量均達(dá)最大。3tween-80培養(yǎng)模式通過(guò)以上實(shí)驗(yàn),確定雅致小克銀漢霉C01菌株適用于二級(jí)發(fā)酵,并得到最佳種子和發(fā)酵培養(yǎng)條件。最佳種子培養(yǎng)條件為1%孢子菌懸液接種,加入0.2%Tween-80,并用八層紗布封口,30℃下,180r/min的恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)48h。最佳發(fā)酵條件為10%的接種量,加入0.1%的Tween-8