淺談大一統(tǒng)與納米粒子的相互作用

淺談大一統(tǒng)與納米粒子的相互作用

為了維持細(xì)胞的正常功能，細(xì)胞必須從環(huán)境中吸收各種物質(zhì)。幾乎所有的真核細(xì)胞都通過內(nèi)吞作用攝取細(xì)胞外基質(zhì)中的大分子,因此細(xì)胞內(nèi)吞是細(xì)胞生理代謝中一個極為重要的現(xiàn)象。目前,已有大量研究涉及大分子以及納米顆粒如何被細(xì)胞識別、結(jié)合、內(nèi)化、分選及在細(xì)胞內(nèi)的分布等相關(guān)內(nèi)容。這些研究證實,細(xì)胞能有選擇地從周圍環(huán)境中攝入物質(zhì),并在一種極精細(xì)的調(diào)節(jié)下將不同的物質(zhì)分別以不同的途徑送到胞內(nèi)不同的區(qū)域。許多藥物只有在細(xì)胞內(nèi)才能有效地發(fā)揮作用,因而利用載體將藥物分子傳輸至細(xì)胞內(nèi)可以大大提高藥物的療效。目前,可以通過多種方法如電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、病毒載體、細(xì)胞穿膜肽等提高藥物分子的細(xì)胞吸收。另外,細(xì)胞對納米粒子的吸收主要通過胞吞途徑進(jìn)行,這些通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的納米粒子將被運輸至溶酶體,并在此被消化降解,從而大大減弱了納米粒子所攜帶藥物的藥效。因此本文作者旨在總結(jié)納米粒子進(jìn)入細(xì)胞的最新研究進(jìn)展,并著重介紹納米粒子的表面特性對細(xì)胞吸收納米粒子的影響,同時還簡要介紹物質(zhì)從內(nèi)涵體中逃逸的策略。1胞吞或其他功能在細(xì)胞的新陳代謝過程中,大分子物質(zhì)及顆粒性物質(zhì)一般不能直接穿過細(xì)胞膜,它們在進(jìn)出細(xì)胞的轉(zhuǎn)運過程中都是通過膜包裹、形成囊泡、與膜融合或斷裂來完成的,故又稱囊泡轉(zhuǎn)運。由于囊泡轉(zhuǎn)運涉及膜的融合與斷裂,因此需要消耗能量,屬于主動運輸。細(xì)胞攝入大分子或顆粒物質(zhì)的囊泡轉(zhuǎn)運過程稱為胞吞作用;細(xì)胞排出大分子或顆粒物質(zhì)的囊泡轉(zhuǎn)運過程稱為胞吐作用。胞吞作用稱內(nèi)吞作用或入胞作用,根據(jù)胞吞物質(zhì)形態(tài),可分為胞飲作用和吞噬作用。其中細(xì)胞對液體及溶解在液體中的溶質(zhì)的攝入過程稱為胞飲作用,而對固體顆粒的攝入過程稱為吞噬作用。1.1細(xì)胞鎖合物胞飲作用根據(jù)入胞機(jī)制的不同又分為網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞飲作用、小窩蛋白介導(dǎo)的胞飲作用和巨胞飲。1.1.1網(wǎng)格蛋白包被囊泡的分離網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞飲作用的具體機(jī)制為細(xì)胞外溶質(zhì)(配體)同細(xì)胞表面特異性受體相結(jié)合,形成配體-受體復(fù)合物,并向有被小窩集中,銜接蛋白識別跨膜受體胞質(zhì)面肽鏈尾部的內(nèi)吞作用信號,將其連接到網(wǎng)格蛋白包被上;網(wǎng)格蛋白在質(zhì)膜胞質(zhì)側(cè)組裝產(chǎn)生的力牽拉質(zhì)膜向內(nèi)凹陷;在動力蛋白作用下,深陷的有被小窩自頸部與質(zhì)膜斷離形成網(wǎng)格蛋白包被囊泡;脫去網(wǎng)格蛋白后形成的裸露轉(zhuǎn)運小泡與早期內(nèi)體融合,最后配體在細(xì)胞內(nèi)被消化。1.1.2內(nèi)吞形成膜小窩是細(xì)胞膜上特定的直徑50～100nm的細(xì)頸瓶狀的膜功能筏,富含膽固醇、鞘磷脂和鞘糖脂,形成一個去垢劑不溶性的膜區(qū)域,并且以存在小窩蛋白為特征。當(dāng)發(fā)生內(nèi)吞作用時,細(xì)胞外溶質(zhì)(配體)與小窩的脂錨定蛋白(受體)特異性結(jié)合,并啟動下游復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而發(fā)生內(nèi)吞作用。小泡形成后,小窩蛋白呈同心圓狀線條覆蓋在小泡胞質(zhì)面成為小窩蛋白包被小泡。包含配體的窩室因不與溶酶體融合,從而避免配體的降解,最后配體以功能活性狀態(tài)被運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)各個位點,或回到細(xì)胞外。1.1.3巨胞飲作養(yǎng)血藥濃對代謝的影響巨胞飲是內(nèi)吞的一種形式,指在某些因素刺激下,細(xì)胞膜皺褶形成大且不規(guī)則的原始內(nèi)吞小泡,它們被稱為巨胞飲體。通常巨胞飲作用能顯著地被細(xì)胞松弛素D和秋水仙堿抑制,提示微管和微絲在這個過程中扮演重要角色。研究結(jié)果表明,巨胞飲受到PI3激酶、Rac1、P21-活化的激酶、肌球蛋白、WASP相互作用蛋白、膽固醇和Rab家族的調(diào)節(jié)。巨胞飲具有清除凋亡細(xì)胞、參與免疫反應(yīng)、介導(dǎo)某些病原菌侵襲細(xì)胞、更新細(xì)胞膜等功能。1.2顆粒表面促進(jìn)血藥濃度的變化吞噬細(xì)胞表面有多種與吞噬機(jī)制相關(guān)的表面受體,如免疫球蛋白的Fc受體、補體受體及模式識別受體(PRRs)等。吞噬作用是一個觸發(fā)過程,外源性顆粒表面病原相關(guān)基序與巨噬細(xì)胞表面特異受體相互作用,使顆粒與細(xì)胞表面結(jié)合,引起攝入部位肌動蛋白聚合及偽足包裹顆粒,然后偽足融合形成囊泡。在胞質(zhì)內(nèi),動力蛋白在囊泡頸部裝配成環(huán),并水解與其結(jié)合的GTP,動力蛋白收縮使囊泡自頸部與細(xì)胞膜斷離形成吞噬體,吞噬體最后與溶酶體融合,結(jié)果病原體被溶酶體內(nèi)的酸性水解酶消化降解。2細(xì)胞穿透肽cpp在分子生物學(xué)研究、基因治療和制藥工業(yè)中,需要將蛋白、多肽、核苷酸、藥物等大分子導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。現(xiàn)有的通過細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運的技術(shù)有電穿孔、顯微注射、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和病毒載體等。因為這些技術(shù)對細(xì)胞具有較強的損傷作用,并且不能避免細(xì)胞內(nèi)溶酶體引起的降解,使得它們的應(yīng)用受到很大的限制。近十多年來,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些具有穿透細(xì)胞膜和(或)核膜的氨基酸序列,內(nèi)化后能定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核,長度多數(shù)為小于30個氨基酸的多肽分子,被命名為細(xì)胞穿透肽(cellpenetratingpeptides,CPP)。它們可以攜帶親水性蛋白、多肽、DNA甚至顆粒性物質(zhì)等進(jìn)行細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運或細(xì)胞內(nèi)傳輸,并且不受細(xì)胞類型的限制,在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療學(xué)以及藥學(xué)等領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用價值(圖1)。其中發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的細(xì)胞穿透肽來源于人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus-1,HIV-1)的轉(zhuǎn)錄活化因子(transactivatingtranscriptionalactivator,Tat)。后續(xù)還發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型單純皰疹病毒(herpessimlexvirusType1,HSV-1)蛋白的VP22和果蠅同源觸角蛋白(drosophilahemeoproteinantennapediatranscriptionprotein,Antp)等。2.1子帶的皇帝膜吸收機(jī)制2.1.1cpp的細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制細(xì)胞對CPP的跨膜吸收機(jī)制以及如何將CPP運用于體內(nèi)現(xiàn)在仍然是一個謎團(tuán)。起初有研究者認(rèn)為,CPP的內(nèi)化機(jī)制是不受胞吞和受體控制的。2003年Richard等修正了原有的CPP細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制,并提出CPP進(jìn)入細(xì)胞的過程主要與內(nèi)涵體途徑有關(guān)。至此,很多種類CPP的細(xì)胞吸收機(jī)制被重新審視,并且報道認(rèn)為CPP主要通過胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞[21,22,23,24,25,26]。盡管現(xiàn)在仍然很難對CPP的細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制建立一些基本的框架,但研究者們在某些方面已達(dá)成一致,比如CPP通過與細(xì)胞膜上的蛋白多糖發(fā)生靜電作用從而與細(xì)胞膜首先發(fā)生接觸,并且CPP的細(xì)胞內(nèi)化途徑主要由以下幾個參數(shù)調(diào)控:(1)CPP的本性和二級結(jié)構(gòu);(2)CPP與細(xì)胞表面和膜磷脂組分發(fā)生相互作用的能力;(3)CPP所攜帶“貨物”的本性、類型和活度;(4)細(xì)胞類型和膜的組成。2.1.2細(xì)胞骨架的重新調(diào)整和細(xì)胞的內(nèi)化機(jī)制蛋白多糖在細(xì)胞表面微區(qū)域的調(diào)控方面發(fā)揮主要作用,同時有證據(jù)表明細(xì)胞骨架構(gòu)造與一部分GTP酶的活化直接相關(guān)。肝素硫酸酯蛋白多糖與黏結(jié)蛋白聚糖是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分,伴隨蛋白激酶C和Rho/RacGTP酶的活化,這些蛋白多糖成簇聚集導(dǎo)致細(xì)胞骨架重新調(diào)整,從而調(diào)控膽固醇富集“筏”微區(qū)域的動力學(xué)行為并最終調(diào)控配體的吸附和細(xì)胞的內(nèi)化機(jī)制。首先CPP通過與細(xì)胞膜上的葡糖胺聚糖發(fā)生靜電吸附從而與細(xì)胞膜發(fā)生接觸,接著肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)重新調(diào)整,并且選擇性活化少部分GTP酶RhoA或Rac1。GTP酶的活化和肌動蛋白的重新調(diào)整預(yù)示著細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制的開始并對細(xì)胞膜的流動性產(chǎn)生重要影響,結(jié)果促進(jìn)Arg8、penetratin和Tat通過大胞飲作用或網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞,而MPG或Pep-1粒子通過膜的微擾機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。2.1.3膜脂質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)與cpp的相互作用由于CPP吸附在葡糖胺聚糖上,這種吸附有利于CPP以及CPP與所載“貨物”形成的復(fù)合物在細(xì)胞表面聚集,同時隨著CPP種類的不同,他們進(jìn)入細(xì)胞有不同的門控。將CPP所攜帶“貨物”的生物學(xué)反應(yīng)與CPP進(jìn)入細(xì)胞的機(jī)制聯(lián)系起來是我們有效利用CPP的首要條件。CPP之間的主要區(qū)別之一在于不同種類的CPP與細(xì)胞表面組分的相互作用模式不同。多肽如Tat、多精氨酸和penetratin與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用首先是靜電作用,并且這種相互作用引發(fā)CPP通過一種能量依賴的胞吞過程進(jìn)入細(xì)胞。盡管大胞飲已經(jīng)被報道為帶正電荷的CPP進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑,CPP還可以通過其它的胞吞途徑如網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白介導(dǎo)的胞吞作用和反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)的內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞。而且,絕大多數(shù)CPP內(nèi)化時,膜轉(zhuǎn)移和胞吞的幾種不同機(jī)制可能同時存在。這對兩親性的多肽而言可能尤其準(zhǔn)確,兩親性的多肽首先與膜磷脂發(fā)生作用并在膜中調(diào)整它的二級結(jié)構(gòu),從而改變細(xì)胞膜的完整性。CPP的二級結(jié)構(gòu)以及它們的動力學(xué)行為是CPP內(nèi)化機(jī)制的主要決定因素。在細(xì)胞表面增加CPP的局部濃度將有利于CPP通過非胞吞的方式進(jìn)入細(xì)胞,并使CPP更多地分散在細(xì)胞質(zhì)中。事實上,以CPP為基礎(chǔ)的納米粒子(如Pep-1和MPG)進(jìn)入細(xì)胞的主要途徑與內(nèi)涵體通道無關(guān)。MPG和Pep-1的細(xì)胞內(nèi)化跟它們與膜磷脂的相互作用能力有關(guān)。MPG或Pep-1主要通過疏水部分和膜磷脂發(fā)生相互作用并形成瞬間的跨膜的螺旋或β結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)可以暫時地影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu),從而有利于MPG或Pep-1插入細(xì)胞膜中并引發(fā)與膜電位有關(guān)的穿膜過程。有生物活性的Pep-1或MPG與所載“貨物”形成的復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)化與導(dǎo)致多肽在細(xì)胞表面局部高濃度的納米粒子的結(jié)構(gòu)直接相關(guān)。2.2傳輸大量“貨物”自從1988年發(fā)現(xiàn)CPP,CPP已經(jīng)被用來傳輸一系列“貨物”如小分子、核酸、抗體和納米粒子等。下面我們將簡要介紹CPP近期在生物和醫(yī)學(xué)中的最新應(yīng)用。2.2.1tat在血腦屏障標(biāo)記的應(yīng)用血腦屏障是機(jī)體參與固有免疫的內(nèi)部屏障之一,由介于血循環(huán)與腦實質(zhì)間的軟腦膜、脈絡(luò)叢的腦毛細(xì)血管壁和包于壁外的膠質(zhì)膜組成,能阻擋病原微生物和其他大分子物質(zhì)通過血循環(huán)進(jìn)入腦組織和腦室。因此如何穿過血腦屏障成為標(biāo)記腦組織的首要難題。利用Tat共價標(biāo)記量子點,通過微導(dǎo)管將Tat標(biāo)記的量子點導(dǎo)入最靠近鼠頸動脈的動脈血管里,Tat可以成功地將量子點非常迅速地傳遞至鼠腦,而且鼠腦中量子點的裝載量很大,以致鼠腦的熒光可見度可以和一盞低功率的手持紫外燈相媲美。自十年前Tat被成功用來傳輸抗體至細(xì)胞內(nèi)以來,Tat傳輸單克隆抗體并用于放射免疫治療與檢測直到最近才有報道。將細(xì)胞內(nèi)周期蛋白依賴性激酶抑制因子p21WAF-1/Cip-1的直接抗體用Tat標(biāo)記后能夠穿越細(xì)胞膜,而且其效率是未標(biāo)記抗體的兩倍之多。2.2.2通過cpp來表達(dá)某些生物活性分子如蛋白質(zhì)、核酸等能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能并產(chǎn)生治療效果。然而由于這些分子不能穿透細(xì)胞膜,在體內(nèi)的藥效可能被削弱,利用CPP攜帶這些分子通過細(xì)胞膜可以大大提高它們的最終效果。對于很多的小分子藥物如紫杉醇、環(huán)孢素A、甲氨蝶呤也是如此。有些藥物與CPP共價結(jié)合后會減弱藥物本身的活性,然而這種不足可以通過CPP將藥物高效率地導(dǎo)入細(xì)胞得到彌補。據(jù)報道CPP與甲氨蝶呤的共軛物的活性比單純的甲氨蝶呤減少20倍,然而這種共軛物卻顯示高效率的細(xì)胞毒性。這些研究表明,CPP能夠有效率地提高生物活性分子在細(xì)胞內(nèi)的濃度,并且這種濃度的提高能夠彌補因共軛標(biāo)記導(dǎo)致的藥物活性的減弱。CPP也可用來傳遞用于調(diào)整基因表達(dá)的siRNA。以前的報道已經(jīng)闡述了利用Tat有效傳遞基因沉默的siRNA到細(xì)胞中,最近Tan等報道了一種新穎的CPP,它可以將大分子或小分子藥物傳輸?shù)窖鄄拷M織,并將它簡稱為POD。POD成功地將siRNA導(dǎo)入到胚胎來源視網(wǎng)膜干細(xì)胞中,并觀察到大于50%的基因沉默。POD仍然可以將質(zhì)粒DNA傳輸?shù)郊?xì)胞中并完成大于50%的基因表達(dá)。而且,在鼠角膜外用POD與染料的共軛物將會使染料有效地分布在附近的眼部組織并迅速地被細(xì)胞吸收。有必要進(jìn)一步地探索在鼠角膜外用POD與核酸的共軛物是否將會使共軛物有效地分布在附近的眼部組織并迅速地被細(xì)胞吸收。然而,這份研究表明,利用CPP提高核酸在眼部組織的傳遞是可能的。2.2.3/nihnp的共紡模擬物在探索更加有效地治療腫瘤的方法時,CPP是一個非常有價值的工具。CPP已經(jīng)得到多方面的創(chuàng)新性應(yīng)用,如用CPP來運輸化療藥物,同時也可以傳遞凋亡前體蛋白。盡管CPP能夠高效地將化療藥物傳輸?shù)郊?xì)胞中,然而對于傳統(tǒng)的CPP如Tat而言,它們對細(xì)胞無特異性,使得腫瘤和正常細(xì)胞都接受化療藥物,從而造成正常細(xì)胞的死亡,這是腫瘤治療中必須解決的問題。為了糾正CPP這種固有的對細(xì)胞的非特異性,有研究將Tat與一種anti-Her-2/neu肽模擬物(AHNP)共軛連接(Tat-AHNP)。AHNP可以選擇性地吸附ErbB2。ErbB2是一種表皮生長因子受體,在乳腺癌細(xì)胞中過量表達(dá)30%。這種設(shè)計新穎的對癌細(xì)胞有特異性的運輸多肽Tat-AHNP將可以用于治療。一種STAT3的抑制多肽STAT3BP能夠阻止STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活性,因此將STAT3BP共軛連接到Tat-AHNP上,利用Tat-AHNP的靶向作用能夠?qū)TAT3BP特異性地運輸?shù)桨┘?xì)胞中,而且這種特異性在體外和體內(nèi)都可以實現(xiàn)。另外,將STAT3BP共軛連接到Tat-AHNP上后并沒有改變STAT3BP的活性,連接在Tat-AHNP上的STAT3BP仍然能夠破壞STAT3的活性,從而引起腫瘤細(xì)胞凋亡并阻止體內(nèi)腫瘤的增長。p14ARF蛋白是一種有效的腫瘤抑制劑,在腫瘤部位它常被解除管制。以前認(rèn)為這個蛋白是一種從p14ARF蛋白的N端衍生得到的含有22個氨基酸殘基的多肽,而這種多肽就能夠模仿結(jié)構(gòu)完整的p14ARF蛋白的功能。對這種多肽的進(jìn)一步考察發(fā)現(xiàn),其精氨酸的含量占總氨基酸含量的20%,由于CPP也常是富含精氨酸的序列,因此這種多肽被用來測試它的跨膜能力。研究發(fā)現(xiàn),這種多肽對細(xì)胞膜有高度的滲透性,并且發(fā)現(xiàn)該多肽能夠傳遞功能剪接正確的PNA到細(xì)胞中。當(dāng)p14ARF與細(xì)胞共孵育時,p14ARF多肽保持了生物活性的細(xì)胞毒性,并能夠使細(xì)胞的增殖減少了45%。這是第一次報道發(fā)現(xiàn)從一種較大蛋白質(zhì)中衍生出來的多肽同時具有抗繁殖性和細(xì)胞穿膜功能。3納米顆粒的膜吸收3.1納米粒子與細(xì)胞的相互作用納米粒子可以運載多種藥物和生物活性大分子如多肽、蛋白質(zhì)和基因等,因此在藥物靶向和控制釋放、免疫檢測和診斷學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。在這些應(yīng)用中,不可避免地涉及到納米粒子與細(xì)胞間的相互作用。因此理解細(xì)胞內(nèi)吞(endocytosis)的機(jī)制和粒子進(jìn)入細(xì)胞的途徑等問題有助于預(yù)測粒子在細(xì)胞中的位置和分布(圖2),為設(shè)計出更有效的載體提供實驗依據(jù)。納米粒子與細(xì)胞及其磷脂雙層結(jié)構(gòu)之間的相互作用對納米粒子在光療、影像、藥物/基因傳輸?shù)确矫娴膽?yīng)用產(chǎn)生非常重要的影響。這些方面的應(yīng)用要求非常穩(wěn)定地控制納米材料與細(xì)胞之間的相互作用,而這種相互作用主要由納米粒子的表面性質(zhì)所決定。3.2納米棒的優(yōu)點研究納米材料的尺寸和形狀對納米材料與細(xì)胞之間的相互作用的影響是非常重要的,因為這種研究可能給毒理學(xué)帶來啟發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)納米粒子的尺寸和形狀會對納米粒子的細(xì)胞吸收產(chǎn)生重要影響。Chithrani等研究了HeLa細(xì)胞分別對14、50、74nm3種金納米粒子的細(xì)胞吸收。結(jié)果顯示,隨著金納米粒子尺寸的不同,金納米粒子的細(xì)胞吸收動力學(xué)以及飽和濃度也隨之改變,并且發(fā)現(xiàn)直徑為50nm的金納米顆粒能夠最有效地被細(xì)胞吸收,這表明納米材料可能有一個最適合細(xì)胞高效吸收的尺寸。同時,有些研究表明,納米粒子的尺寸強烈地影響細(xì)胞膜受體的吸附和活化進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。此外,在研究納米材料對細(xì)胞的作用時,必須對納米材料固有的多分散性進(jìn)行控制,否則用同種材料的不同批次進(jìn)行細(xì)胞研究時可能得到不同的研究結(jié)果。另外一個必須考慮的問題是,即使納米材料在合成后具有一定的尺寸,然而在細(xì)胞的體外和體內(nèi)研究中,這些納米材料可能聚集,聚集體的形貌和尺寸可能與原納米材料完全不同,從而影響實驗結(jié)果和我們對實驗結(jié)果的理解。與此同時,納米材料的形貌對細(xì)胞吸收也有影響。細(xì)胞對球形粒子的吸收數(shù)量比它對棒狀粒子的吸收數(shù)量多5倍,這是因為細(xì)胞膜對納米棒的包裹需要更多的時間。Kostarelos等在碳納米管上共價修飾不同類型的小分子,這些功能化的碳納米管顯示出很強的被細(xì)胞內(nèi)化的能力,而且這種功能化的碳納米管能夠以非能量依賴的方式進(jìn)入哺乳類細(xì)胞和原核細(xì)胞,并能通過細(xì)胞內(nèi)的各種障礙在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。單根的碳納米管或碳納米管束一旦與細(xì)胞接觸,即使在胞吞被抑制的條件下,仍能夠向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運并且觀察到碳納米管能夠向核周邊轉(zhuǎn)移。功能化碳納米管的圓柱形結(jié)構(gòu)和它大的長徑比,使它好比一個納米注射器,能夠允許它們穿透細(xì)胞膜。根據(jù)細(xì)胞類型、碳納米管尺寸和碳納米管束含量的不同,其它的細(xì)胞吸收機(jī)制(如吞噬作用)可能也對碳納米管的內(nèi)化吸收有貢獻(xiàn),或者這些內(nèi)化機(jī)制被碳納米管的這種穿膜能力所激發(fā),因此這些機(jī)制直接與功能化的碳納米管的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運有關(guān)。3.3納米粒子表面覆蓋物對復(fù)合材料細(xì)胞內(nèi)全覆蓋的影響納米粒子表面電荷會對納米粒子與細(xì)胞之間的相互作用產(chǎn)生重要影響。前面我們提到納米粒子的尺寸和形狀對納米粒子與細(xì)胞之間的相互作用有重要影響,然而,納米粒子表面的多功能基團(tuán)對納米粒子的許多重要性質(zhì)如溶解性、大分子和細(xì)胞表面之間的相互作用產(chǎn)生主要影響。例如,納米粒子在培養(yǎng)液中與細(xì)胞共孵育時,血清蛋白將吸附在納米粒子的表面,這將導(dǎo)致納米粒子通過受體介導(dǎo)的方式進(jìn)入細(xì)胞。然而,在很多的應(yīng)用中,又要盡量避免納米粒子與細(xì)胞膜或其他的生物分子發(fā)生相互作用。例如,在體內(nèi)的應(yīng)用中,蛋白質(zhì)在納米粒子表面的非特異性吸附將導(dǎo)致納米粒子凝聚并被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除,這將阻礙納米粒子運送藥物/基因到靶向位置。非特異性還可以導(dǎo)致納米粒子吸附在細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)上,從而導(dǎo)致無效率的標(biāo)記和檢測。為了避免這種情況,可以在納米粒子表面包覆電中性的配體如聚乙二醇(PEG),其中PEG因能抵抗蛋白質(zhì)的吸附而著稱。Xie等研究得出在單分散的Fe3O4納米粒子表面包覆PEG后,納米粒子在培養(yǎng)條件下的團(tuán)聚將可以忽略,同時巨噬細(xì)胞對納米粒子的非特異性吸收也減少。另外,還有研究通過改變納米粒子表面PEG的量和聚合物構(gòu)型來考察它們對納米粒子細(xì)胞內(nèi)化的影響。研究顯示,單一地提高PEG在納米粒子表面的濃度并不能減少納米粒子的細(xì)胞吸收,相反,PEG在粒子表面的空間構(gòu)型自由度將產(chǎn)生決定性的作用。納米粒子表面PEG化的聚合物的不同分子結(jié)構(gòu)中,PEG組分在納米粒子表面暴露越多,將會更多地減小納米粒子對蛋白質(zhì)的吸附,同時納米粒子與細(xì)胞的相互作用也更小,盡管此時PEG的總體含量相對較少。另外有研究表明,與被PEG包覆的量子點相比,被羥基包覆的量子點更能明顯地減少對細(xì)胞的非特異性吸附。這些研究表明,如果電中性配體在納米粒子表面合理分布,這些配體將能夠明顯地減少納米粒子與它們所處的生理環(huán)境的非特異性相互作用。3.4通過壓力產(chǎn)生的納米顆粒與細(xì)胞之間的相互作用3.4.1氧化鐵納米顆粒的細(xì)胞內(nèi)化納米粒子表面的帶電官能團(tuán)也能夠影響納米粒子與細(xì)胞之間的相互作用。當(dāng)納米粒子表面電中性的官能團(tuán)能夠很好地阻止不必要的納米材料與生物分子的相互作用,絕大多數(shù)的帶電官能團(tuán)是納米粒子與細(xì)胞發(fā)生相互作用的誘因。有證據(jù)表明,帶負(fù)電的粒子可被細(xì)胞吸收,盡管帶負(fù)電的粒子與帶負(fù)電的細(xì)胞膜存在排斥作用。Villanueva等研究了表面被帶不同價電的碳水化合物功能化的氧化鐵納米粒子被HeLa細(xì)胞的吸收情況。結(jié)果顯示,表面不帶電的氧化鐵納米粒子沒有顯示出任何的細(xì)胞內(nèi)化,然而,隨著納米粒子表面涂層的不同,表面帶負(fù)電的納米粒子能夠被細(xì)胞吸收,并顯示一定的毒性。通過輔助的磁性實驗、磁泳、電子自旋共振譜發(fā)現(xiàn),由于對細(xì)胞膜的強烈相互作用和非特異性,帶負(fù)電的沒有表面分子涂層的氧化鐵納米顆粒顯示高水平的細(xì)胞內(nèi)化能力。帶負(fù)電的納米粒子的細(xì)胞內(nèi)化,首先是細(xì)胞膜上帶正電的位置對納米粒子的非特異性吸附且納米粒子在此位置成簇聚集,接著細(xì)胞通過胞吞作用將納米粒子內(nèi)化。值得注意的是,與細(xì)胞膜上帶負(fù)電的區(qū)域相比,細(xì)胞上帶正電的區(qū)域相對稀少。被羧基功能化的第三代的PAMAM樹枝狀聚合物穩(wěn)定的氧化鐵納米粒子,也能夠被HeLa細(xì)胞內(nèi)化,內(nèi)化途徑可能是通過胞吞或者直接擴(kuò)散通過細(xì)胞膜。Patil等研究了隨pH改變的Zeta電位對氧化鈰納米粒子的細(xì)胞吸收的影響。研究結(jié)果表明,與帶正電的粒子相比,帶負(fù)電的粒子對牛血清白蛋白的吸附較少,并且肺癌株細(xì)胞對帶負(fù)電的納米粒子有更高效的吸收。另外,帶負(fù)電的直徑大約在30nm的量子點不僅能夠被細(xì)胞內(nèi)化,而且能夠穿透小鼠的皮膚,且這種穿透隨著紫外輻射而加劇。最近,我們課題組用過硫酸鉀引發(fā)丙烯酸在酪蛋白水溶液中聚合得到酪蛋白-聚丙烯酸納米空心球,然后將酪蛋白-聚丙烯酸納米空心球經(jīng)pH7.4左右的水透析處理,得到純酪蛋白的納米空心球。在pH7.4左右時,通過Zeta電位測試表明該酪蛋白納米空心球的表面帶負(fù)電。酪蛋白納米空心球用羅丹明B異氰酸酯共價標(biāo)記,然后將該納米微球在37℃、4℃或各種胞吞阻斷試劑(即疊氮鈉、制霉菌素、非律平、細(xì)胞松弛素D、諾考達(dá)唑)存在下與細(xì)胞共孵育。用激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),4℃或各種胞吞的阻斷試劑都不能有效地阻止酪蛋白納米粒子進(jìn)入細(xì)胞,同時我們還用激光共聚焦顯微鏡和透射電鏡發(fā)現(xiàn)納米粒子進(jìn)入細(xì)胞后主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。這些表明酪蛋白納米空心球有很強的進(jìn)入細(xì)胞的能力,并且這種能力不受溫度、能量的影響。3.4.2細(xì)胞穿膜能力與電中性或帶負(fù)電的粒子和細(xì)胞之間的弱相互作用以及低水平的細(xì)胞內(nèi)化相比,帶正電的粒子能夠非常顯著地與細(xì)胞膜上帶負(fù)電的基團(tuán)(如唾液酸)發(fā)生吸附并跨過細(xì)胞膜。例如,Cho等最近檢測金納米粒子的表面電荷對其被細(xì)胞吸收的影響,發(fā)現(xiàn)通過使用碘/碘化鉀刻蝕劑(刻蝕金核),能夠選擇性地溶解附著在細(xì)胞上的納米粒子的金核。研究發(fā)現(xiàn),與表面帶正電的納米粒子相比,表面不帶電或帶負(fù)電的納米粒子在帶負(fù)電的細(xì)胞膜上吸附的少得多,從而導(dǎo)致進(jìn)入細(xì)胞的納米粒子個數(shù)也相對較少。由于帶正電的粒子具有很高的穿膜和細(xì)胞內(nèi)化效率,它們成為藥物和基因傳輸?shù)氖走x人工合成載體。為了利用帶正電粒子的細(xì)胞內(nèi)化,Martin等用樹枝形的胍修飾超順磁性的氧化鐵納米粒子,結(jié)果顯示,表面經(jīng)胍修飾的納米粒子像CPP一樣具有細(xì)胞穿膜能力;與表面氨基化的粒子相比,這些納米粒子具有更強的細(xì)胞穿膜能力,盡管它們也顯示相對較高的細(xì)胞毒性。Harush-Frenkel等研究了帶電粒子的胞吞機(jī)制,結(jié)果表明帶負(fù)電的納米粒子胞吞速度較低,帶正電的納米粒子通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞機(jī)制迅速被細(xì)胞內(nèi)化;另外,當(dāng)阻斷網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞途徑時,其它的胞吞途徑也能夠使帶正電的納米粒子高度內(nèi)化。PEG化的氨基包覆的量子點也已經(jīng)被用來作為強勁的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記試劑。研究發(fā)現(xiàn),納米粒子帶正電荷的多少和納米粒子被細(xì)胞內(nèi)化的數(shù)目具有很強的關(guān)聯(lián)。盡管當(dāng)納米粒子的表面電荷密度較低時,硅納米粒子主要通過網(wǎng)格蛋白和肌動蛋白依賴的胞吞方式進(jìn)入細(xì)胞,在某些細(xì)胞中硅納米粒子表面很強的價電涂層將使納米粒子繞過這些細(xì)胞內(nèi)化機(jī)制。帶正電的硅納米粒子還能夠逃脫內(nèi)涵體并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。另外一個研究比較了不同表面涂層的橢圓體量子點的細(xì)胞內(nèi)化,并觀察到納米粒子進(jìn)入皮膚細(xì)胞的數(shù)量遵循如下順序:QD-COOH>QD-NH2>QD-PEG。盡管納米粒子表面帶有荷正電的官能團(tuán),然而可以觀察到表面官能團(tuán)(如疏水含量或結(jié)構(gòu))的細(xì)微變化都可以導(dǎo)致納米粒子細(xì)胞內(nèi)化數(shù)量的改變,這表明納米粒子的表面性質(zhì)對它與細(xì)胞之間的相互作用的影響是非常復(fù)雜的,而且這種復(fù)雜程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出我們現(xiàn)在的理解水平。此外,Leroueil等研究了帶正電的PAMAM樹枝形聚合物對細(xì)胞膜磷脂雙分子層的影響。他們發(fā)現(xiàn)帶正電的第七代的PAMAM不僅可以打破細(xì)胞膜的穩(wěn)定性,而且通過AFM觀察發(fā)現(xiàn)它還可以在細(xì)胞膜上形成15～40nm的孔,或者加大已經(jīng)在缺陷位置存在的孔。進(jìn)一步的研究表明,帶正電的粒子在磷脂雙分子層形成孔的這一性質(zhì)是普遍存在的,不管粒子是球形還是不規(guī)則形狀、化學(xué)組成是有機(jī)物還是金或硅納米粒子等無機(jī)物、粒子是柔性還是剛性、價電密度和粒子尺寸大小。另外,本課題組通過在70℃殼聚糖(CS)和丙烯酸(AA)的混合水溶液里加入氯金酸,利用CS的還原性得到Au納米粒子,然后加入過硫酸鉀引發(fā)AA聚合得到CS-PAA-Au雜化納米微球。這種在pH7.4左右表面帶正電的雜化納米微球不僅可以作為藥物向細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞核傳輸?shù)妮d體,而且可以作為癌細(xì)胞造影劑,因此這種納米粒子可以同時起到細(xì)胞造影和抗癌藥物運輸兩種功能。更重要的是,CS-PAA-Au在核內(nèi)和核膜周圍聚集表明,這種雜化納米粒子具有進(jìn)入細(xì)胞核的能力。3.5細(xì)胞內(nèi)路徑和細(xì)胞轉(zhuǎn)運脂質(zhì)體(liposomes)是由磷脂、膽固醇等為膜材包合而成。磷脂分散在水中時能形成多層微囊,且每層均為脂質(zhì)雙分子層,各層之間被水相隔開,這種微囊就是脂質(zhì)體。由于脂質(zhì)體可以包裹不透膜的親水性分子或?qū)⒛と苄缘氖杷肿訑y帶在磷脂雙分子層中,現(xiàn)在很多的研究都致力于將脂質(zhì)體作為藥物傳輸?shù)臐撛谳d體。細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運是基因載體轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的決定因素。Iwasa等研究了由八精氨酸表面修飾的脂質(zhì)體(R8-liposome)的細(xì)胞跨膜吸收機(jī)制。他們將NIH3T3細(xì)胞在37℃或4℃與R8-liposome共孵育,流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在4℃跨膜吸收的R8-liposome只比相應(yīng)的37℃時略微減少。激光共聚焦顯微鏡對脂質(zhì)體和細(xì)胞膜雙成像發(fā)現(xiàn),在37℃時R8-liposome通過囊泡轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞,而且部分R8-liposome從囊泡中逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并分散在細(xì)胞核的周邊;在4℃時激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)R8-liposome分布在細(xì)胞內(nèi)靠近細(xì)胞膜的某一特殊區(qū)域,并且沒有觀察到細(xì)胞膜的內(nèi)化。因此,R8-liposome在4℃的細(xì)胞吸收看起來不是通過能量依賴的囊泡轉(zhuǎn)運方式,而是通過其它的特殊途徑。同時,在4℃時R8-liposome將包裹的pDNA傳輸?shù)郊?xì)胞核的效率不及它在37℃的細(xì)胞核轉(zhuǎn)運效率。此研究結(jié)果表明,R8-liposome可以通過非胞吞的方式進(jìn)入細(xì)胞,而且R8-liposome的細(xì)胞內(nèi)化途徑與接下來的向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運過程密切相關(guān)。RNA干預(yù)在醫(yī)學(xué)中應(yīng)用的關(guān)鍵挑戰(zhàn)是如何將合成的小干擾RNA(siRNA)有效地傳輸?shù)桨屑?xì)胞,從而誘導(dǎo)目標(biāo)基因的沉寂。為了推動非病毒載體的合理發(fā)展,Lu等研究了陽離子脂質(zhì)體傳輸siRNA到哺乳類細(xì)胞的機(jī)制。他們發(fā)現(xiàn)95%的siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物是通過胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞的,并延長了復(fù)合物在內(nèi)涵體和溶酶體中的停留時間。然而,將網(wǎng)格蛋白、小窩蛋白或脂筏介導(dǎo)的胞吞作用和大胞飲作用抑制后,并不能阻止目標(biāo)基因的沉寂。相反,將膽固醇從細(xì)胞膜中移除后,對siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物的跨膜吸收影響很小,但卻解除了對目標(biāo)基因的沉寂。同時發(fā)現(xiàn)功能性siRNA的傳輸在幾小時內(nèi)發(fā)生,并且隨著溫度的降低,這種傳輸逐漸被阻止。此研究表明,盡管大部分siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物是通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞的,然而一種次要的通過siRNA脂質(zhì)體復(fù)合物與細(xì)胞膜的融合的內(nèi)化途徑卻承擔(dān)功能性siRNA的傳輸。此研究為我們提高陽離子脂質(zhì)體傳輸功能性siRNA的效率指示了可能的方向。Kunisawa等建立了一種將脂質(zhì)體包裹納米粒子的方法,并將包裹有納米粒子的脂質(zhì)體與用紫外線滅活的仙臺病毒融合得到基因融合脂質(zhì)體。當(dāng)納米粒子包裹進(jìn)傳統(tǒng)的脂質(zhì)體時,納米粒子通過胞吞的方式進(jìn)入細(xì)胞。相反,當(dāng)將納米粒子包裹入基因融合脂質(zhì)體時,很多的納米粒子將被傳輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中且沒有細(xì)胞毒性。此外,基因融合脂質(zhì)體顯示出很強的將包裹在其中的攜帶有DNA的納米粒子傳輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)的能力。此研究結(jié)果表明利用基因融合脂質(zhì)體與納米粒子的組合納米技術(shù)是一個有價值的系統(tǒng),它能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)以基因為主體的藥物的藥代動力學(xué)。3.6金納米粒子與細(xì)胞的作用在很多的研究中,用天然的生物組分如寡核苷酸、多肽或蛋白質(zhì)取代合成有機(jī)分子來對納米粒子進(jìn)行包覆,同時考察這些納米粒子與細(xì)胞之間的相互作用。最近,Rosi等對寡核苷酸修飾的金納米粒子的細(xì)胞內(nèi)化進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn),即使納米粒子表面帶負(fù)電,納米粒子仍然能夠被鼠內(nèi)皮細(xì)胞吸收并能有效地用于基因調(diào)控。起初,這種現(xiàn)象看起來是吃驚的,因為帶負(fù)電的納米粒子典型地難以被細(xì)胞內(nèi)化。然而,通過以熒光為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)定量實驗進(jìn)一步分析得出,寡核苷酸修飾的金納米粒子通過靜電和疏水作用在其表面吸附血清蛋白,吸附了血清蛋白的納米粒子能夠與細(xì)胞膜相互接觸。同時研究發(fā)現(xiàn),納米粒子的細(xì)胞內(nèi)化依賴于裝載在粒子表面的寡核苷酸的密度,粒子表面寡核苷酸的密度越高,納米粒子進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量越大。這些研究表明,在經(jīng)典的細(xì)胞培養(yǎng)孵育實驗中,納米粒子最外層的血清吸附蛋白對納米粒子與細(xì)胞膜之間的相互作用是一個重要的決定因素。3.7金納米粒子的排列雖然有很多納米粒子表面官能團(tuán)/配體/穿膜單元對其細(xì)胞吸收的影響的研究報道,而納米粒子表面配體的排列對其細(xì)胞內(nèi)化的影響卻很少有研究。Verma等合成了用有機(jī)物包裹的兩親性的金納米粒子,所有的粒子都具有相同的尺寸、電位、配體堆積密度和疏水組分含量,唯一的不同在于包裹金核的配體的排列。研究表明,包裹在金核上的兩親性分子如果以有序的帶狀交替排列,則該納米粒子在4℃和胞吞阻斷試劑存在的情況下仍然能穿透細(xì)胞膜;如果無序排列,該納米粒子將不能穿越細(xì)胞屏障而只能被胞吞進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)涵體中。這些表面兩親性分子以有序地帶狀交替排列的納米粒子在穿越細(xì)胞膜時并沒有在膜上呈現(xiàn)明顯的孔洞結(jié)構(gòu),這非常類似于細(xì)胞穿膜肽。3.8egf靶向治療乳腺癌的活性任何藥物及其傳輸載體在體內(nèi)應(yīng)用時都存在不同程度的副作用。通過對癌細(xì)胞表面的特異性受體或配體的識別,則能將化療藥物或其它醫(yī)藥試劑靶向到癌細(xì)胞,這將極大地減少藥物對其它正常細(xì)胞的毒性,并提高癌癥治療的效率。許多細(xì)胞表面受體如葉酸受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、上皮生長因子受體等都被用來選擇性靶向載藥納米粒子到腫瘤細(xì)胞。Kocbek等制備了用血管內(nèi)皮生長因子修飾的聚電解質(zhì)復(fù)合膠束,并可特異性靶向到結(jié)腸癌細(xì)胞。在負(fù)載紫杉醇的PLGA納米粒子表面修飾HER2(humanepidermalgrowthfactorreceptor-2)的抗體(trastuzumab),使粒子具有靶向到乳腺癌細(xì)胞并在癌細(xì)胞中釋放藥物的多功能性。上皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)是上皮生長因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體,在許多實體腫瘤中高表達(dá)或異常表達(dá)。EGFR與腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。EGF共價連接到載有抗癌藥物或顯像劑的傳輸載體上后,將能使藥物特異性傳輸?shù)紼GFR過量表達(dá)的細(xì)胞(如胰腺癌細(xì)胞)中。最近,Bhirde等將順鉑和EGF連接到單壁碳納米管(SWNT)上,并發(fā)現(xiàn)EGF能將該碳納米管靶向到EGFR過量表達(dá)的鱗片狀的癌細(xì)胞HNSCC中。通過利用量子點(Qdot)熒光和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),SWNT-Qdot-EGF生物軛合物能夠迅速地被癌細(xì)胞內(nèi)化,并且HNSCC能夠在體外被選擇性地殺死,同時抑制體內(nèi)腫瘤生長。Fujita等將兩種不同的單克隆抗體共價連接到同一種基于聚蘋果酸的納米粒子上,其中的一種單克隆抗體anti-TfR指導(dǎo)納米粒子通過血瘤屏障,而另外一種單克隆抗體2C5靶向瘤細(xì)胞表面連接的核小體。同一納米粒子表面連接有兩種抗體以及它們的生物活性通過酶聯(lián)免疫吸附實驗確證。同時,體內(nèi)實驗表明,表面連接有兩種抗體的納米粒子在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤部位高度富集。4被胞吞物質(zhì)的生物活性大部分大分子和納米粒子的細(xì)胞內(nèi)化是通過內(nèi)吞方式進(jìn)行的,內(nèi)吞后大分子和納米粒子局限于內(nèi)涵體內(nèi),并最終被溶酶體消化降解,這會大大消弱被胞吞物質(zhì)的生物學(xué)活性。因此,探索促進(jìn)被胞吞物質(zhì)從內(nèi)涵體中逃逸的方法,將有助于提高被輸送生物活性物質(zhì)的效率。下面簡要介紹CPP介導(dǎo)的物質(zhì)從內(nèi)涵體中逃逸的方法。4.1tat-10h編碼熒光光素酶的轉(zhuǎn)染W(wǎng)attiaux等在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入氯喹,幾個小時后發(fā)現(xiàn),熒光標(biāo)記的TAT多肽可使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均呈明顯著色,證明氯喹可促進(jìn)TAT多肽從內(nèi)涵體中逃逸至細(xì)胞質(zhì)并進(jìn)入細(xì)胞核。Tat與聚組氨酸共價連接得到Tat-10H,結(jié)果組氨酸的咪唑基團(tuán)(PKa6.0)在酸性的內(nèi)涵體(pH5～6.5)中充當(dāng)質(zhì)子海綿。當(dāng)Tat-10H被細(xì)胞吸收并進(jìn)入內(nèi)涵體后,組氨酸殘基的質(zhì)子化將導(dǎo)致滲透性腫脹,結(jié)果內(nèi)涵體膜破裂,從