煙曲霉感染診斷方法

煙曲霉菌感染的實驗室檢查方法周艷(綜述)煙曲霉菌為空氣中常見的腐生菌，為一種機會致病真菌，其孢子直徑很小，可被動吸入呼吸道，在一般的環(huán)境下，人們每天都能吸入上百個煙曲霉菌孢子，但是通常情況下都不致病。近20年來隨著廣譜抗生素的濫用、腫瘤放療和化療，造血干細胞移植術(shù)、實體器官移植術(shù)后應(yīng)用免疫抑制劑及糖皮質(zhì)激素等藥物以及腸外營養(yǎng)人數(shù)的增加以及艾滋病的流行等免疫抑制人群逐年增長[1]，臨床上越來越多的免疫力低下的人群感染煙曲霉菌導(dǎo)致侵襲性肺曲霉病（invasivepulmonaryaspergillosis,IPA）。侵襲性曲霉菌感染的發(fā)病率日益增長，其發(fā)病率已經(jīng)超過了最常見的真菌感染—侵襲性念珠菌病。免疫力低下的老年病人發(fā)生侵襲性曲霉菌感染后的死亡率也一直居高不下。IPA以肺部感染為主，主要為急性壞死性出血性肺炎，并可波及骨骼、腦、肝、腎、心臟等全身多個重要器官，其預(yù)后極差，死亡率高達80％－90％[2]。由于IPA的發(fā)病機制尚未闡明，從而導(dǎo)致IPA的診斷極為困難，治療成功率很低。為此，發(fā)展有效的煙曲霉菌感染實驗室檢查方法對于該病的診斷與治愈顯得尤為重要，目前常見的實驗室檢測方法有：顯微鏡檢查、病原生物學(xué)培養(yǎng)方法、血清免疫學(xué)檢測法、分子生物學(xué)檢測法等。本文就這些方法的研究作一綜述。關(guān)鍵詞：煙曲霉菌；聚合酶鏈反應(yīng)；血清學(xué)診斷顯微鏡檢查顯微鏡檢查主要包括直接顯微鏡檢查和組織病理學(xué)檢查，都是以形態(tài)學(xué)特點為基礎(chǔ)來對病原微生物進行診斷。曲霉菌直接鏡檢呈現(xiàn)玻璃樣透明的菌絲，但是其菌絲結(jié)構(gòu)特點的特異性并不突出，其他種類相似的真菌如青霉菌亦可呈現(xiàn)類似的鏡下特點。另一方面，組織病理學(xué)檢查雖也是侵襲性曲霉菌感染確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，病理表現(xiàn)為真菌菌絲侵入和定植于組織或者血管造成炎癥改變。但是其報告總中經(jīng)常會出現(xiàn)曲霉樣形態(tài)學(xué)特點等描述性的診斷結(jié)果，這對在鏡下類似曲霉菌類的其他病原微生物的鑒別診斷帶來一定的困難，誤診的出現(xiàn)幾乎不可避免。若是發(fā)生誤診的兩種病原微生物的治療方案相差較大，就會嚴重影響治療效果，從而進一步導(dǎo)致預(yù)后不良。此外，檢查者的主觀因素也有可能對診斷結(jié)論產(chǎn)生影響。病原微生物的培養(yǎng)病原微生物的培養(yǎng)是診斷細菌與真菌感染的常規(guī)方法，特異性高，同時還可以用于細菌與真菌感染的藥敏試驗，為臨床合理使用抗生素提供可靠的依據(jù)。標(biāo)本病原微生物的培養(yǎng)結(jié)果是侵襲性曲霉菌感染確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”，這是曲霉菌感染的診斷基礎(chǔ)[3]。煙曲霉菌培養(yǎng)是通過取病人血液、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液（BAL）、尿液及感染病理組織等標(biāo)本，接種于真菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，其中血液、BAL及感染組織為常用的取材標(biāo)本。各實驗室采用的培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度時間各有不同，如蔡氏培養(yǎng)基適用26℃培養(yǎng)3-4天，沙保培養(yǎng)基適用35℃培養(yǎng)1-2天，但因為培養(yǎng)時間長且敏感性不高，因而可能延誤病人的診斷和治療。與白色念珠菌、新型隱球菌等單細胞真菌比較，煙曲霉菌為絲狀型真菌，組織的機械破碎對絲狀真菌成活力及培養(yǎng)有很大影響[4]。此外，由于曲霉菌是機會致病菌，從有菌區(qū)獲取的陽性培養(yǎng)結(jié)果并不能明確是由于定植的正常菌群或是侵襲性感染所致。3、血清免疫學(xué)檢測法血清免疫學(xué)檢測法是一種診斷病原因子感染的經(jīng)典方法，原理是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)特異性的免疫學(xué)原理，檢查患者血清、腦脊液、BAL、尿液等體液標(biāo)本中病原因子特異的抗原或抗體。在煙曲霉菌感染血清學(xué)檢測法的研究報道中，眾多實驗室研究的檢測法都是圍繞半乳甘露聚糖（GM）抗原而展開的。有研究[5]結(jié)果提示：采用酶免疫測定法（EIA）檢測BAL標(biāo)本中煙曲霉GM抗原有利于早期診斷并且指導(dǎo)治療；閾值的設(shè)立對于EIA法的檢測結(jié)果敏感性和特異性會有影響。從49名確診為侵襲性肺曲霉?。↖PA）的個體和50名疑為IPA的個體采集的BAL標(biāo)本，進行GMEIA的檢測，當(dāng)閾值設(shè)為1.0時，敏感性為61%；檢測閾值為0.5時，敏感性為76%；相應(yīng)的特異性分別為98%和94%。另外，從22名BAL標(biāo)本煙曲霉培養(yǎng)陰性病人獲取標(biāo)本做GMEIA測定，當(dāng)檢測閾值為1.0時，敏感性為41%；檢測閾值為0.5時，敏感性為59%[6]。還有實驗室采用實驗誘導(dǎo)建立兔IPA模型，然后用GMEIA方法檢測分析。當(dāng)最佳閾值為0.75時，未處理對照組的敏感性和特異性都達到100%；而抗真菌治療組敏感性下降到92%[7]。另外，該實驗存在一定的假陽性，也無法區(qū)別定植還是感染。還有實驗室發(fā)展了一種基于檢測抗-Afmp1p抗原的抗體的酶聯(lián)免疫吸附測定實驗誤差，這些問題往往限制了PCR方法在IPA診斷中的使用[24]?？傊?，PCR診斷技術(shù)是一項快速、敏感、特異性好的診斷技術(shù)，對煙曲霉感染的輔助診斷很有意義。但是因為各實驗室采用的檢測方法不一，檢測標(biāo)本來源及靶基因也各有不同，以及采集標(biāo)本來自抗真菌治療病人等等影響了煙曲霉感染PCR診斷的重現(xiàn)性和可靠性。為此，我們迫切需要煙曲霉感染PCR診斷技術(shù)的實驗規(guī)范化。PCR法的檢測結(jié)果與真菌感染之間的關(guān)系、臨床診斷價值以及指導(dǎo)臨床抗真菌治療作用方面，有待進一步研究。5、其他的診斷方法除了上述四種煙曲霉感染診斷的常用方法，還有其他的一些診斷方法用于煙曲霉感染的診斷，如：活檢組織菌絲顯影法，擴增片段長度多態(tài)現(xiàn)象分析法（AFLP[25]，BG試驗法[3]等。伴隨煙曲霉感染診斷技術(shù)的不斷改良，快速、敏感、特異地診斷煙曲霉感染越來越被人們所關(guān)注。各實驗室在改良實驗技術(shù)的同時，通過各種實驗技術(shù)的結(jié)合用于煙曲霉感染的診斷，互補各實驗技術(shù)的優(yōu)缺點。如：AndreaFrancesconi和MikiKasai等研究表明應(yīng)用GMEIA和定量實時PCR合并診斷BAL標(biāo)本中煙曲霉菌特異性抗原和DNA能提高檢測的敏感性和特異性，減少診斷時間，從而早期正確使用抗真菌藥物，改善煙曲霉菌感染，并且可以防止診斷陰性結(jié)果病人的濫用抗真菌藥物[7]。BirgitSpiess和DieterBuchheidt等建立了一種低循環(huán)控制實時PCR，其測定方法快速、敏感、特異，能定量化檢測高危病人BAL標(biāo)本和血標(biāo)本中煙曲霉DNA。這是一種結(jié)合了實時PCR和低循環(huán)控制PCR的新型檢測方法。實時PCR的敏感性比低循環(huán)控制PCR好，但后者用于檢測真菌荷載比前者好，兩種PCR方法相結(jié)合而成的低循環(huán)控制實時PCR法值得我們關(guān)注[6]。CatrionaHalliday和QiXuanWu等結(jié)合實時PCR和巢式PCR并應(yīng)用低循環(huán)控制PCR系統(tǒng)發(fā)展了一種巢式定量實時PCR檢測技術(shù)。這種新型檢測煙曲霉感染的PCR技術(shù)因為結(jié)合了巢式PCR技術(shù)比普通實時PCR技術(shù)敏感性高，并且比傳統(tǒng)的巢式PCR技術(shù)快速[17]。SvetlanaChallier和StephanieBoyer等發(fā)展了一種檢測血清煙曲霉菌DNA的特異性實時PCR技術(shù)結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)能提高侵襲性曲霉病的診斷率[26]。CorneliaLass-Florl和EberhardGunsilius等評價抗真菌藥物治療期間全血標(biāo)本的PCR閾值時發(fā)現(xiàn)：一旦標(biāo)本來源于抗真菌藥物治療后病人，PCR診斷的優(yōu)點被限制，因此推薦結(jié)合使用真菌培養(yǎng)法和顯微鏡檢查法提高真菌檢測的敏感性[19]。結(jié)語隨著臨床上煙曲霉感染發(fā)病率的增多，并且預(yù)后極差，死亡率高達80％－90％，迫切需要發(fā)展一種快速、敏感、特異、規(guī)范化的診斷技術(shù)致力于早期發(fā)現(xiàn)煙曲霉菌感染，早期治療煙曲霉感染，以及防止陰性感染結(jié)果病人的抗真菌藥物濫用。隨著對曲霉菌菌體抗原結(jié)構(gòu)的不斷研究，不排除在未來能夠發(fā)現(xiàn)更具有特異性的曲霉菌抗原成分，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)新型的血清學(xué)與分子生物學(xué)檢測方法，IPA的診診斷技術(shù)的會得到不斷提高和規(guī)范化。參考文獻1ChaiLY，HsuLY.Ｒecentadvancesininvasivepulmonaryaspergillosis[J]．CurrOpinPulmonMed，2011;17(3):160-6.2JEAN-PAULLATGE.AspergillusfumigatusandAspergillosis[J].CLINICALMICROBIOLOGYREVIEWS,Apr.1999,310–350.3GulloA.Invasivefungalinfections:thechallengecontinues[J]．Drugs，2009;69(suppl1):69-73.4Sheppard1DC.,MarrKAandFredricksDN.Comparisonofthreemethodologiesforthedeterminationofpulmonaryfungalburdeninexperimentalmurineaspergillosis[J].ClinMicrobiolInfect2006;12:376–380.5FoyPC，vanBurikJA，WeisdorfDJ．Galactomannanantigenenzymelinkedimmunosorbentassayfordiagnosisofinvasiveaspergillosisafterhematopoieticstemcelltransplantation［J］．BiolBloodMarrowTransplant，2007，13(4):440－443．6BenjaminMusher,DavidFredricksandWendyLeisenring.2004.AspergillusGalactomannanEnzymeImmunoassayandQuantitativePCRforDiagnosisofInvasiveAspergillosiswithBronchoalveolarLavageFluid［J］.JOURNALOFCLINICALMICROBIOLOGY,Dec.2004,p.5517–5522.7AndreaFrancesconi,MikiKasai,RutaPetraiti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