苦杏仁蛋白功能特性的影響因素研究

苦杏仁蛋白功能特性的影響因素研究

苦杏仁是薔薇科杏屬植物杏、杏、遼杏和西伯利亞杏的成熟種子。據報道,每100g苦杏仁中含有蛋白質25~27g、油脂47~56g、碳水化合物及粗纖維12~19g,另外還富含多種礦質元素(鈣、磷、鐵、硒等)和維生素(VE、VB1、VB2、VB5、VC等),具有豐富的營養(yǎng)價值和良好的藥用價值?？嘈尤实鞍字泻?7種氨基酸,種類齊全,含量豐富,其中8種人體必需氨基酸與總氨基酸的比值(EAA/TAA)約為28.37%,接近于國際參考模式(FAO/WHO),是一種良好的植物蛋白,在食品加工領域有著廣闊的應用前景。目前,提取苦杏仁蛋白傳統方法仍為堿溶酸沉法,但較長時間熱堿液浸提易造成蛋白質的變性和有害物質的生成,對蛋白后續(xù)加工利用造成不良影響。本研究以脫脂脫苷杏仁粉為原料,采用稀鹽溶液浸提及等電點鹽析相結合的方法提取、制備苦杏仁蛋白,系統研究溫度、pH值、NaCl濃度、蛋白質量濃度等因素對苦杏仁蛋白功能特性(溶解性、持水性、吸油性與乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、起泡穩(wěn)定性)的影響,以期為其深入研究和更好地應用于食品加工工業(yè)提供理論依據。1材料和方法1.1菜籽油、牛血清蛋白、考馬斯亮藍g-20添加量山杏(PrunusarmeniacaL.),購于陜西;低溫榨油后的低變性苦杏仁粕,由西北農林科技大學林學院提供;菜籽油市售。牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250(生化級別)上海伯奧生物科技有限公司;氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、95%乙醇、磷酸(分析純)西安試劑公司;濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銨(分析純)四川西隴化工有限公司。1.2儀器器:細KDN-01A型凱氏定氮儀、PHS-3C型酸度計、722型光柵分光光度計上海精密科學儀器有限公司;國華85-2恒溫磁力攪拌器常州國華電器有限公司;AnkeLXJ-IIB低速大容量多管離心機上海安亭科學儀器廠;HHS-2S電力恒溫水浴鍋上海卓爵儀器設備有限公司;LGJ-10D冷凍干燥機北京四環(huán)科學儀器廠;高速組織搗碎機上海比朗儀器有限公司等。1.3方法1.3.1苦杏仁苷的提取低溫榨油后的低變性杏仁粕經干燥、粉碎,以石油醚(BP30~60℃)按料液比1:2(m/V)浸提2次進行脫脂處理。干燥后用95%乙醇,以料液比1:7(m/V)于回流狀態(tài)下浸提2次,除去苦杏仁苷。浸提結束后,經干燥,放于密閉容器中,冷藏備用。1.3.2不同浸提液液制備采用稀鹽溶液浸提及等電點-鹽析相結合的方法提取、制備苦杏仁蛋白。具體操作如下:將脫脂脫苷杏仁粉按料液比1:37(m/V)加入含有0.19mol/LNaCl的磷酸緩沖液(0.05mol/L,pH7.0)中,在56℃條件下磁力攪拌浸提50min。浸提結束后,4500r/min離心15min,獲取上清液,杏仁沉淀繼續(xù)浸提2次,合并3次浸提上清液。用1mol/LHCl調至苦杏仁蛋白等電點4.1,加入一定量固體硫酸銨,使溶液中硫酸銨飽和度達到45%,于4℃靜置過夜,5000r/min離心30min;上清液繼續(xù)追加硫酸銨,使溶液硫酸銨飽和度達到60%,4℃靜置過夜,5000r/min離心30min。合并兩次鹽析得到的蛋白沉淀,用蒸餾水水洗若干次至中性,用少量磷酸緩沖液(0.05mol/L,pH7.0)溶解,轉入相對分子截留量為8000~12000的透析袋中進行透析,利用1%BaCl2進行檢測,至水中不再含有SO42-,真空冷凍干燥得到苦杏仁蛋白。1.3.3測定蛋白質含量的測定采用微量凱氏定氮法測定樣品中總氮的含量。蛋白質的含量=總氮含量×6.25(1)1.3.4苦杏仁蛋白溶解度測定參照文獻的方法,并做適當修改。具體操作如下:準確稱取0.5g樣品加入25mL蒸餾水或含有一定離子濃度的NaCl溶液中,并用0.1mol/L的HCl或NaOH調至不同pH值,于一定溫度條件下水浴中攪拌30min,3000r/min離心15min,沉淀不溶蛋白,采用Bradford法測定上清液中蛋白含量,根據公式(2)計算苦杏仁蛋白溶解性。1.3.5苦杏仁蛋白持水性測定參照文獻的方法,并做適當修改。具體操作如下:準確稱取1.0g樣品于離心管中,逐步加少量一定pH值及NaCl濃度的蒸餾水,玻棒攪拌至樣品呈現漿狀、無水析出,將玻棒在管壁上拭凈,再加入1~2mL蒸餾水沖洗后,使混合物于一定溫度條件下靜置一定時間,于5000r/min離心5min,傾去離心管中多余的水,稱取沉淀的質量,根據公式(3)計算苦杏仁蛋白持水性。1.3.6苦杏仁蛋白吸色拉油的測定參照文獻的方法,并做適當修改。具體操作如下:稱取1g樣品于離心管中,加入5mL菜籽油,用玻棒攪拌均勻,于一定溫度條件下靜置一定時間,以5000r/min離心10min,傾去離心管中多余的油,稱取沉淀的質量,根據公式(4)計算苦杏仁蛋白吸油性。1.3.7苦杏仁蛋白乳化性測定參照文獻[11-12]的方法,并做適當修改。具體操作如下:稱取一定量的蛋白樣品溶于100mL蒸餾水或一定濃度的NaCl溶液中,配制成一定質量濃度的蛋白質溶液,用0.1mol/L的HCl或NaOH調至不同pH值,加入相同體積的菜籽油,在一定溫度恒溫水浴放置30min,然后在高速組織搗碎機中以10000r/min的速率均質2min,快速移取25mL乳化溶液以2000r/min的速率離心10min,根據公式(5)計算苦杏仁蛋白乳化性。將上述測定完乳化性后的樣品,于60℃恒溫水浴中放置30min,用自來水冷卻至室溫,以2000r/min的速率離心10min,測定此時乳化層高度,根據公式(6)計算苦杏仁蛋白乳化穩(wěn)定性。1.3.8苦杏仁蛋白的均質性測定參照文獻的方法,并做適當修改。具體操作如下:稱取一定量的蛋白樣品溶于100mL蒸餾水或一定濃度的NaCl溶液中,配制成一定質量濃度的蛋白質溶液,并用0.1mol/L的HCl或NaOH調至不同pH值,在一定溫度恒溫水浴中放置30min,在高速組織搗碎機中以10000r/min均質2min,快速記錄均質停止時泡沫的體積,根據公式(7)計算苦杏仁蛋白的起泡性。在室溫條件下,記錄均質停止30min后泡沫體積,根據公式(8)計算苦杏仁蛋白的起泡穩(wěn)定性。2結果與分析2.1ph值對白溶解度的影響蛋白質溶解性指可溶性蛋白在吸水后分散成膠體的性質,與其他多種蛋白功能特性如起泡性、乳化性、凝膠性等之間具有密切聯系。較好的蛋白溶解性對蛋白后續(xù)應用于食品工業(yè)具有重要的意義。由圖1A可知,苦杏仁蛋白在其等電點pI4.1附近時,蛋白溶解性最小,只有12.79%,而在偏離等電點的酸性或堿性條件下,溶解性呈現增大趨勢,溶解曲線整體呈現“V”字型,并且在堿性條件下蛋白溶解性高于酸性條件。這是因為溶液pH值在蛋白等電點附近時,蛋白質分子所帶正負電荷為零,此時較弱的靜電斥力導致蛋白分子間聚合程度增大,從而導致溶解度最小;而在偏離等電點的酸性或堿性條件下,蛋白質與水分子間作用增強,分散性增大,溶解性呈現逐漸增大趨勢。由圖1B可知,當溫度在25~55℃時,苦杏仁蛋白的溶解性隨溫度的上升而增大,當溫度達到55℃時溶解性達到65.2%,溫度繼續(xù)上升,溶解性降低。這是因為,在低溫條件下蛋白質分子隨溫度的上升,分子構象發(fā)生輕微改變,立體構象發(fā)生伸展,蛋白分子與水分子相互作用增強,表現出溶解性增大的趨勢;但當溫度高于55℃時,蛋白質空間構象中弱鍵斷裂,包含在分子內部的一些疏水基團暴露到分子表面,蛋白質發(fā)生熱變性,蛋白分子間作用增強,出現凝聚現象,因此溶解度降低。由圖1C可知,當c(NaCl)<0.8mol/L時,苦杏仁蛋白的溶解性隨NaCl濃度的增大呈增大趨勢,而在c(NaCl)>0.8mol/L,蛋白溶解性逐漸降低。這是因為在低濃度電解質作用下,蛋白質分子表面所帶電荷增加,與水分子結合能力增強,促使蛋白質分子在水中的溶解程度增大;與之相反,若溶液中電解質濃度增大超過一定值后,由于發(fā)生鹽析效應,使得蛋白分子與水分子結合能力減弱,溶解性減小。2.2ph值對持水性的影響蛋白質持水性是用來衡量蛋白產品吸附水的能力大小的一項重要指標?？嘈尤实鞍壮炙耘cpH值、溫度及靜置時間關系如圖2A~C所示。由圖2A可知,在蛋白等電點pH4.1附近時,苦杏仁蛋白持水性最小,只有3.0g/g,在一定范圍內持水性均隨pH值的增加而增大,在pH值為10.0時持水性達到最大值4.9g/g,但當pH>10.0時,持水性反而降低。這是因為pH值可影響改變蛋白質分子的離子作用、帶電荷數,從而改變蛋白分子間相互作用以及與水分子間結合能力。當pH值處于等電點時,蛋白質分子總電荷為零,分子間相互作用最大,締合和收縮的蛋白質呈現最低的水化和膨脹。由圖2B可知,當溫度在25~45℃時,苦杏仁蛋白的持水性隨溫度的上升而增大,當溫度達到45℃時持水性達到最大,溫度繼續(xù)上升,持水性降低?？赡艿脑蚴?在低溫條件下,蛋白質分子隨溫度的上升,苦杏仁蛋白發(fā)生適度變性,伸展性增大,蛋白分子與水分子間作用增大,從而提高了產品的吸水性。但隨著溫度的繼續(xù)上升,蛋白分子氫鍵作用和離子基團的水合作用減弱、水解程度加劇,或是蛋白變性發(fā)生聚集作用,從而使蛋白表面吸水性下降。由圖2C可知,隨著時間的增加,苦杏仁蛋白持水性總體呈現上升的趨勢,在50min后上升趨勢減弱。可能的原因是在適宜的溫度下,苦杏仁蛋白適度變性,隨時間的增長,蛋白吸水更加充分,持水性增大;在50min時達到平衡,隨時間的延長,持水性變化不僅不再增大,還略有下降。2.3蛋白吸色拉油的測定蛋白質的吸油性是指蛋白質與游離油脂相結合的能力。蛋白質的吸油性與蛋白質的種類、來源、加工方法、溫度及所用的油脂等有關,本研究只考慮溫度、靜置時間對苦杏仁蛋白吸油性的影響,結果如圖3A、B所示。由圖3A可知,在25~35℃時,苦杏仁蛋白吸油性較好,但隨著溫度的繼續(xù)升高,苦杏仁蛋白吸油性呈現減小趨勢。這是因為,隨著溫度的升高,油的黏性降低,流動性增大,與蛋白樣品之間相互吸附作用減弱,從而降低了蛋白吸油性。由圖3B可知,適宜的溫度條件下,隨著時間的延長,蛋白質吸油性有所增大,但當時間繼續(xù)延長超過50min時,此時苦杏仁蛋白吸油性達到3.0g/g,苦杏仁蛋白吸油性增加幅度不再增大,趨于飽和狀態(tài)。2.4ph值對乳化能力的影響蛋白質可以在分散的油滴和連續(xù)水相的界面上吸附,使液滴產生抗凝集性的物理學(如靜電斥力)、流變學性質(如黏度),這使得其在食品乳膠體中具有穩(wěn)定作用,是重要的食品添加成分。其中,蛋白質乳化性是指蛋白樣品與油水結合在一起,形成乳狀液經相轉變(從O/W乳狀液轉變成W/O乳狀液);乳化穩(wěn)定性是指油水乳化液保持穩(wěn)定的能力?？嘈尤实鞍椎娜榛约叭榛€(wěn)定性與pH值、溫度、NaCl濃度及蛋白質量濃度關系見圖4A~D所示。由圖4A可知,苦杏仁蛋白在其等電點pH4.1附近時,乳化性和乳化穩(wěn)定性較差,分別為52.4%和69.2%,在pH值偏離等電點時,乳化性、乳化穩(wěn)定性均呈現增大趨勢,這與pH值對蛋白溶解度影響呈現趨勢一致?？赡艿脑蚴?在等電點附近時蛋白分子所帶電荷為零,靜電排斥作用使得蛋白溶解度最小,在蛋白顆粒表面又無法形成水化層,從而使得形成的乳化粒子易發(fā)生絮凝和聚集,乳化能力最弱。在偏離等電點時,蛋白溶解性增加,蛋白質向油/水界面擴散能力增強,乳化顆粒間靜電斥力作用使乳化能力增強,保持其形成乳化液能力增強。由圖4B可知,苦杏仁蛋白乳化性在25~55℃范圍內隨溫度的上升而增加,在45℃時,乳化穩(wěn)定性達到最高,乳化性在55℃達到最大值67.6%,溫度繼續(xù)上升可使乳化性及其穩(wěn)定性下降?？赡艿脑蚴?適度的熱處理會使蛋白分子的伸展程度增大,這使得蛋白分子更加容易的吸附在油水界面上,但繼續(xù)加熱,蛋白質會發(fā)生熱變性,溶解性降低,另外高溫使乳化顆粒運動加劇,并且降低吸附在界面上的蛋白質凝膠作用,使得蛋白質膜黏度、硬度降低,乳化性及其乳化穩(wěn)定性下降。由圖4C可知,在一定范圍內苦杏仁蛋白乳化能力隨NaCl濃度升高有所提高,當濃度升高至0.6mol/L,乳化性達到最大,之后乳化性、穩(wěn)定性隨NaCl濃度繼續(xù)升高持續(xù)下降,分別由75.7%降至61.5%、89.6%降至72.7%。這是因為,在低NaCl濃度作用下,參與乳化作用的蛋白質量濃度增大,由于電荷作用使得蛋白分子間斥力減小,使油滴更容易吸附在蛋白界面,但當NaCl濃度過高時,鹽離子壓縮了膠體的擴散雙電層,破壞了靜電復合物的形成,乳化能力下降。由圖4D可知,隨著蛋白質量濃度的增加,乳化性、乳化穩(wěn)定性呈現增大趨勢,當質量濃度大于4g/100mL時,乳化性、乳化穩(wěn)定性增大幅度趨于平緩。這表示,隨著蛋白質量濃度增大,界面膜的厚度增加,從而提高了膜的強度,乳化性能得到提高。但當蛋白質量濃度繼續(xù)增大至苦杏仁臨界膠束質量濃度(CMC)4g/100mL時,參與界面作用的蛋白質不再增加,達到飽和狀態(tài),乳化能力不再提高,此時不溶性蛋白顆粒對乳狀液穩(wěn)定作用也達到最佳狀態(tài)。2.5ph值對苦杏仁蛋白變形劑穩(wěn)定性的影響蛋白質起泡性是指蛋白樣品在攪打過程中撲捉氣體最終形成泡沫的能力;泡沫穩(wěn)定是指泡沫形成后的維持能力,也就是泡沫間液膜保持液體不被析出的能力?？嘈尤实鞍椎钠鹋菪约捌鹋莘€(wěn)定性與pH值、溫度、NaCl濃度及蛋白質量濃度關系見圖5A~D。由圖5A可知,苦杏仁蛋白溶液在pH2.0~4.0之間時,隨著pH值增大,蛋白起泡性下降至47%,但與之相反的是,在這一過程中蛋白穩(wěn)定性增加;繼續(xù)增大溶液pH值,蛋白起泡性呈增大趨勢,對應的穩(wěn)定性降低?？赡艿脑蚴?當pH值在等電點附近時,參與形成泡沫的蛋白質量濃度較低,使得其泡沫量最少,但此時不溶性顆粒由于靜電作用吸附于氣-液界面,使得蛋白膜黏性、厚度增大,泡沫穩(wěn)定性增加。由圖5B可知,苦杏仁蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性在25~55℃范圍內隨溫度的上升而增加,溫度繼續(xù)上升起泡性及起泡穩(wěn)定性下降?？赡艿脑蚴?適度的熱處理會使蛋白分子伸展程度增大,提高其在水中溶解性,從而促進了蛋白質分子向氣一液界面移動;當溫度過高時,蛋白質熱變性加劇,溶解度降低,另外高溫又會導致蛋白質膜黏度降低、氣泡破裂和泡沫解體,從而降低了蛋白起泡穩(wěn)定性。由圖5C可知,苦杏仁蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性均隨NaCl濃度的提高呈先增強后減弱的趨勢。當NaCl濃度在0.8mo1/L時,蛋白質的起泡能力達到最大。原因在于,NaCl的加入使得蛋白質的溶解度、黏度、展開和聚集狀態(tài)發(fā)生變化,因而能改變起泡性質。由圖5D可知