甜高粱蔗糖積累規(guī)律及其莖稈汁酒發(fā)酵試驗(yàn)研究

甜高粱蔗糖積累規(guī)律及其莖稈汁酒發(fā)酵試驗(yàn)研究

0利用甜高爐特性生產(chǎn)燃料酒精目前，原油是世界能源使用的主要部分，占世界能源使用總額的37%。同時(shí)，由于這種不可替代的化石燃料，一些能夠重建、可持續(xù)、高效、低成本、便捷、安全的能源開(kāi)發(fā)和使用尤為重要。近年來(lái)，已經(jīng)出現(xiàn)從可再生的資源中生產(chǎn)酒精用于替代石油燃料的研究。酒精可以從各種含糖的物質(zhì)原料中獲取，甜高粱是生產(chǎn)酒精原料中較為有前景的原料之一。甜高粱（Sorghumbiocolor(L.)Moench）是一種C4作物，具有很高的光合作用速率，同時(shí)與高粱的其他種屬相比，甜高粱具有較高的生物學(xué)產(chǎn)量和糖產(chǎn)量。就生物學(xué)特性而言，甜高粱生物學(xué)產(chǎn)量較高，一般莖稈產(chǎn)量為45000～75000kg/hm2，還可產(chǎn)3000～6000kg/hm2的籽粒；抗逆性強(qiáng)，一般甜高粱具有很強(qiáng)的抗旱和耐澇性，同時(shí)還具有較強(qiáng)的抗鹽堿能力；適應(yīng)范圍廣，只要10℃以上的積溫達(dá)到1500°～2500℃，選擇合適的品種，在一般耕地、草原或輕鹽堿地均可種植。作為能源作物而言，甜高粱的莖稈富汁多糖、籽粒富含淀粉、稈渣富含纖維素和半纖維素，均為發(fā)酵制取燃料酒精的合適原料。因此，結(jié)合其生物學(xué)特性，將其作為一種能源作物用于生成燃料酒精，應(yīng)具有良好的推廣和應(yīng)用前景。目前，在甜高粱優(yōu)良品種的選育、栽培和莖稈汁液發(fā)酵制取燃料酒精等方面取得了一定的研究成果，但生產(chǎn)成本較高是限制甜高粱制取燃料酒精發(fā)展的主要障礙，而降低生產(chǎn)成本的主要瓶頸是甜高粱原料可供給的時(shí)間較短、酒精生產(chǎn)企業(yè)年實(shí)際的生產(chǎn)時(shí)間較短以及設(shè)備閑置時(shí)間較長(zhǎng)。因而，本研究從甜高粱的種植期入手，研究同一地區(qū)不同種植期甜高粱莖稈糖分累積的規(guī)律，以選擇在該地區(qū)甜高粱的較好種植時(shí)間，以便延長(zhǎng)甜高粱莖稈的可供給時(shí)間；同時(shí)，應(yīng)用不同的發(fā)酵工藝方式分別對(duì)甜高粱莖稈汁液進(jìn)行酒精發(fā)酵研究，以確定合適的甜高粱莖稈汁液發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精的方式。1材料和方法1.1陽(yáng)農(nóng)業(yè)品種—供試品種供試品種為“沈農(nóng)甜雜2號(hào)”甜高粱，由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)選育，1987年通過(guò)遼寧省科委鑒定，為生產(chǎn)酒精的再生能源甜高粱品種；1991年通過(guò)國(guó)家飼料牧草新品種審定。1.2病毒南陽(yáng)酵母（Saccharomycescerevisiae），上海交通大學(xué)生物質(zhì)工程研究中心保藏。1.3固定化材料固定化材料選用海藻酸鈉(AR)、氯化鈣(AR)以及戊二醛(BR)等。1.4不同處理的播種量選擇試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)于2005年在上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行。土質(zhì)為黃棕壤，土壤有機(jī)質(zhì)含量為24.821g/kg，含全氮1.798g/kg，堿解氮65.1mg/kg，速效磷17.0mg/kg，速效鉀142.1mg/kg,pH值為7.7。試驗(yàn)分兩個(gè)處理,處理Ⅰ的播種時(shí)間為2005年5月2日，小區(qū)面積為64.03m2；處理Ⅱ的播種時(shí)間為2005年6月7日，小區(qū)面積為42.69m2。每個(gè)處理各設(shè)3個(gè)重復(fù)。種植規(guī)格：壟寬為30cm，壟溝寬為30cm；每壟種1行，行距為60cm，穴距為30cm；種植密度為44000棵/hm2ㄢ種植方式：條播和移栽。施肥方法：農(nóng)家肥加少量復(fù)合肥，用量為12000～15000kg/hm2，拔節(jié)期前追施尿素450～600kg/hm2ㄢ田間管理程序：播種后灌1次水，種植后5～7天松土除草；種植后15天移栽補(bǔ)苗，3～4周后間苗；拔節(jié)前期進(jìn)行除草大培壟，并灌水1次；中期噴施濃度為0.02%～0.04%的樂(lè)果防治蚜蟲(chóng)。1.5酒精發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)取不同種植期的甜高粱中總糖含量較高、收獲時(shí)間較晚的莖稈汁液用于酒精發(fā)酵。同時(shí)，酒精發(fā)酵工藝選取固定化酵母和游離態(tài)酵母兩種方式，分別在5L機(jī)械攪拌式的生物反應(yīng)器中進(jìn)行酒精發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)。發(fā)酵過(guò)程中，定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液中酒精含量和總糖含量，對(duì)比發(fā)酵過(guò)程中原料的酒精轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵時(shí)間，以確定較佳的發(fā)酵工藝流程。1.6分析1.6.1甲基紅指示劑溶液制備總糖測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸法（DNS）。取2mL甜高粱莖稈汁液于100mL容量瓶，加蒸餾水50mL后，加5mL亞鐵氰化鉀；然后加入5mL乙酸鋅，定容至100mL，離心后從中取50mL溶液于100mL容量瓶，加1MHCl5mL，置于70℃恒溫水浴加熱15min；冷卻后，加2滴甲基紅指示劑，并用20%的NaOH中合至中性定容至100mL，取1～25mL比色管并加入2mLDNS試劑，置于100℃沸水浴中，2min后冷卻定容至25mL；用分光光度計(jì)在540nm處比色，測(cè)定其吸光度，并查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。1.6.2以乙酸鈉為原料，，定容、離心取2mL甜高粱莖稈汁液于100mL容量瓶，加蒸餾水50mL后，加5mL亞鐵氰化鉀；然后，加入5mL乙酸鋅，定容至100mL，離心；取1mL清液至25mL比色管，并加入2mLDNS試劑，置于100℃沸水浴中，2min后冷卻定容至25mL，用分光光度計(jì)在540nm處比色，測(cè)定其吸光度，并查標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度。1.6.3瓶中添加0.0.5%自由密封的蒸餾取100mL發(fā)酵成熟醪液到500mL蒸餾瓶中，加100mL蒸餾水混合均勻進(jìn)行蒸餾；取餾出液100mL，用酒精比重計(jì)測(cè)定蒸出液的酒精酒度，同時(shí)校正至20℃時(shí)的酒度。2結(jié)果與分析2.1不同種植期甜高爐莖糖和總糖含量的變化甜高粱莖稈汁液富含糖分，可用于發(fā)酵制取燃料酒精，或者直接用于制糖。因而，作為能源作物和糖料作物，甜高粱莖稈糖分的高低是衡量甜高粱莖稈利用價(jià)值的重要指標(biāo)。由于不同種植期的甜高粱在生長(zhǎng)環(huán)境的水、熱、光照等條件上具有差異，勢(shì)必導(dǎo)致甜高粱莖稈糖分的積累產(chǎn)生一定的差異。甜高粱在苗期至抽穗期主要植株處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，其糖分屬于無(wú)積累階段。因而，從抽穗期開(kāi)始研究甜高粱莖稈的糖分含量具有重要的意義。不同種植期甜高粱抽穗期后天數(shù)與莖稈總糖含量關(guān)系如圖1所示。由圖1可知，在上海地區(qū)5月初種植的“沈農(nóng)甜雜2號(hào)”甜高粱和6月初種植的甜高粱其莖稈中總糖的含量都經(jīng)歷先升、后降、再升、再降的過(guò)程，呈現(xiàn)“M”變化趨勢(shì)。這可能是由于甜高粱在抽穗期后植株主要處于糖分積累快速增長(zhǎng)階段，這一時(shí)期光照充足，溫度較高，致使植株代謝活動(dòng)增強(qiáng)、葉片光合作用效率高，除少量光合作用產(chǎn)物用于灌漿外，大部分用于莖的糖分積累，因而莖稈中的總糖含量處于上升趨勢(shì)。此后，甜高粱籽粒形成并逐漸加快生長(zhǎng)，導(dǎo)致甜高粱莖稈糖分積累緩慢，總糖含量呈下降趨勢(shì)，而后出現(xiàn)莖稈糖分升降的波動(dòng)。從總糖波動(dòng)變化的時(shí)間上看，6月初種植的甜高粱要比5月初種植的甜高粱晚一周左右。這說(shuō)明，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，推遲甜高粱的播種期25～30天左右，能延長(zhǎng)甜高粱糖分在莖稈中保持時(shí)間10～14天。兩個(gè)播種期的甜高粱都是在抽穗期后21天左右出現(xiàn)了第一次總糖積累的峰值，且后一播種期的甜高粱的總糖積累量要高于前一播種期。這說(shuō)明，在上海地區(qū)6月份以后的氣候較為適合“沈農(nóng)甜雜2號(hào)”甜高粱的莖稈生長(zhǎng)期糖分積累。從莖稈糖含量的平均水平上來(lái)看，6月初種植的甜高粱的莖稈總糖含量的平均水平為127.37mg/mL，而5月初種植的甜高粱則為68.14mg/mL,6月初種植的甜高粱的莖稈總糖含量的平均水平比5月份初種植的甜高粱高出46.5%。還原糖含量的平均水平分別為34.4mg/mL和31.05mg/mL，兩者差異不大。多水分、低溫度和少光照條件將會(huì)降低甜高粱莖稈糖分的含量。不同種植期甜高粱抽穗后天數(shù)與莖稈還原糖含量的關(guān)系如圖2所示。甜高粱莖稈汁液中的還原糖主要是葡萄糖和果糖。由圖2可以看出：兩個(gè)種植期的甜高粱在抽穗后莖稈中還原糖含量波動(dòng)變幅不大。結(jié)合圖1還可看出，還原糖和總糖含量呈現(xiàn)一種互補(bǔ)的趨勢(shì)，即在總糖含量有大幅增加時(shí)，還原糖含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)；總糖含量大幅減小時(shí)，還原糖含量出現(xiàn)上升趨勢(shì)。這說(shuō)明，甜高粱光合作用最初在莖稈中的產(chǎn)物是葡萄糖。在植物生理中，葡萄糖和果糖是合成蔗糖的物質(zhì)基礎(chǔ)。糖是甜高粱作為能源作物和糖料作物的物質(zhì)基礎(chǔ)，結(jié)合上面分析的糖分變化規(guī)律，在上海地區(qū)種植“沈農(nóng)甜雜2號(hào)”甜高粱作為能源作物和糖料作物，其播種期應(yīng)考慮選擇在5月末或6月初。因而，通過(guò)調(diào)節(jié)甜高粱的播種期可以延長(zhǎng)其收獲期和糖分在莖稈中的保持期，對(duì)充分利用糖廠和酒精廠的加工設(shè)備、降低燃料酒精成本具有一定的意義。2.2固定化酵母發(fā)酵工藝在本研究中供試的甜高粱為5月初種植，采收于2005年12月4日，其莖稈經(jīng)壓汁后，向汁液添加0.2%的(NH4)2SO4,0.125%的K2HPO4和0.05%的MgSO4等無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽，并滅菌。用1MHCl和1MNaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5后，用于固定化酵母酒精發(fā)酵和游離態(tài)酒精發(fā)酵試驗(yàn)。發(fā)酵條件：溫度為（31±0.1）℃，轉(zhuǎn)速為（150±5)r/min。發(fā)酵結(jié)果如圖3和圖4所示。由圖3可以看出，固定化酵母發(fā)酵甜高粱莖稈汁液制取酒精的整個(gè)發(fā)酵時(shí)間為7h，而游離態(tài)酵母酒精發(fā)酵的總發(fā)酵時(shí)間為22h。對(duì)于同一糖度水平的甜高粱莖稈汁液而言，運(yùn)用固定化技術(shù)發(fā)酵制取酒精相對(duì)于傳統(tǒng)的游離態(tài)發(fā)酵技術(shù)可以縮短發(fā)酵時(shí)間至原來(lái)的1/3左右；同時(shí)，在固定化酵母酒精發(fā)酵過(guò)程中，平均總糖轉(zhuǎn)化速度為11.29g/h·L，最大的糖轉(zhuǎn)化速率為15.54g/h·L。而對(duì)于游離態(tài)酵母酒精發(fā)酵，其平均的總糖轉(zhuǎn)化速率為3.70g/h·L，其中最大的糖轉(zhuǎn)化速率為10.36g/h·L。兩者之間的最大糖轉(zhuǎn)化速率相差不多，而平均轉(zhuǎn)化速率固定化酵母酒精發(fā)酵比游離態(tài)酵母酒精發(fā)酵高出67.22%，說(shuō)明固定化技術(shù)發(fā)酵制取酒精技術(shù)具有較高的啟動(dòng)速率，而且整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵速率比較穩(wěn)定，并保持較高的發(fā)酵速率。由圖4可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中，固定化酵母和游離態(tài)酵母發(fā)酵甜高粱莖稈汁液最終所獲得酒精濃度分別為4.3%（v/v）和4.2%（v/v）。固定化酵母酒精發(fā)酵的平均酒精生成速率為4.88g/h·L，最大酒精生成速率為6.40g/h·L；而對(duì)于游離態(tài)酵母酒精發(fā)酵，其最大的酒精生成速率僅為1.53g/h·L，而最大的酒精生成速率為3.40g/h·L。通過(guò)比較兩種發(fā)酵方式的酒精得率可以看出，固定化技術(shù)的酒精得率為85.34%，而游離態(tài)酵母發(fā)酵的酒精得率為81.02%。通過(guò)對(duì)圖3和圖4的分析表明，固定化酵母發(fā)酵制取酒精技術(shù)在發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵速率以及酒精得率等方面的指標(biāo)均明顯優(yōu)于游離態(tài)的酒精發(fā)酵。其主要原因是在酒精發(fā)酵過(guò)程中存在著發(fā)酵底物和發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)酵母代謝的抑制；而在固定化酵母細(xì)胞發(fā)酵制取酒精的系統(tǒng)中，酵母細(xì)胞的密度較大，且具有較高的微生物活性，同時(shí)該系統(tǒng)的發(fā)酵過(guò)程還是一個(gè)傳質(zhì)與代謝同時(shí)存在的過(guò)程，因而傳質(zhì)的存在減弱了底物抑制和產(chǎn)物抑制的作用，而固定化系統(tǒng)中較高的酵母細(xì)胞密度和較高的微生物活性提高了發(fā)酵反應(yīng)的速率。因而，固定化酵母技術(shù)用于甜高粱莖稈汁液發(fā)酵制取酒精較傳統(tǒng)的游離態(tài)酵母發(fā)酵制取酒精具有較高的發(fā)酵速率和發(fā)酵穩(wěn)定性；同時(shí)，固定化酵母粒子容易制備，且成本較低，還可以在連續(xù)酒精發(fā)酵過(guò)程中反復(fù)使用，節(jié)約了培養(yǎng)酵母的能耗和原料。因此，在應(yīng)用甜高粱莖稈汁液發(fā)酵制取燃料乙醇的工藝中，應(yīng)用固定化酵母技術(shù)是一種較為合適的工藝類型。它可以通過(guò)縮短發(fā)酵周期來(lái)減少因甜高粱貯存而需要消耗的能量，同時(shí)還可以在酒精生產(chǎn)過(guò)程中提高生產(chǎn)設(shè)備的利用率水平，以提高經(jīng)濟(jì)效益。3不同酵母發(fā)酵甜高爐秸稈制備的對(duì)比試驗(yàn)1)通過(guò)比較不同播種期的甜高粱在其糖分積累期的糖分積累規(guī)律以及糖分變化規(guī)律可以得出，其總糖含量自抽穗期以后呈“M”型變化規(guī)律。6月初種植的甜高粱其莖稈汁液的總糖含量的平均水平比5月初種植的甜高粱高46.50%，而還原糖含量的平均水平分別