利用分子標(biāo)記構(gòu)建結(jié)球甘藍(lán)抗病基因飽和遺傳圖譜

利用分子標(biāo)記構(gòu)建結(jié)球甘藍(lán)抗病基因飽和遺傳圖譜

結(jié)球甘草是我國(guó)重要的蔬菜品種之一。甘藍(lán)根腫病是由蕓苔根腫菌(PlamodiophorabrassicaeWoron.)侵染引起的一種世界性真菌病害。近年來,該病在我國(guó)的發(fā)病面積急劇增加,造成甘藍(lán)產(chǎn)量和品質(zhì)大幅度降低,選育抗病品種成為防治根腫病的重要途徑之一。因甘藍(lán)對(duì)根腫病抗性屬于數(shù)量性狀遺傳,由多基因控制,易受環(huán)境影響。利用常規(guī)育種方法改良甘藍(lán)對(duì)根腫病的抗性非常緩慢,很難滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和市場(chǎng)的需要。如果選用分子標(biāo)記構(gòu)建甘藍(lán)抗病基因飽和遺傳圖譜,把大量甘藍(lán)抗病蟲基因或數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitativetraitlocus,QTL)定位在染色體上,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行精細(xì)定位和克隆單個(gè)QTL,再利用分子標(biāo)記輔助育種,將給傳統(tǒng)育種帶來革命性的變化。到目前為止,甘藍(lán)類作物的遺傳圖譜己構(gòu)建了十幾張,絕大多數(shù)標(biāo)記為RFLP標(biāo)記,其次是RAPD標(biāo)記,還有少量同工酶標(biāo)記以及SCAR和STS等基于PCR的標(biāo)記,大多對(duì)抗根腫病育種意義不大。本研究的目的就是在不同的環(huán)境下,利用不同的鑒定方法對(duì)甘藍(lán)材料進(jìn)行抗根腫病鑒定,同時(shí)選用SSR標(biāo)記初步構(gòu)建甘藍(lán)抗根腫病的分子連鎖圖譜,為進(jìn)一步的根腫病基因定位和分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料以抗根腫病自交系R15和感根腫病自交系S14組配的180個(gè)F2單株做為作圖群體。1.2提取的dna甘藍(lán)葉片DNA的提取采取改良的CTAB法。1.3ssr-pcr檢測(cè)dna2)、50.00μmol/LdNTPs、0.40UTaqDNA聚合酶、0.4μmol/LSSR引物、1μLDNA(60.00ng/μL),加ddH2O至終體積10.00μL。SSR-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性45S,60℃退火,72℃延伸1min,每個(gè)循環(huán)低0.5℃,20個(gè)循環(huán);94℃變性45S,55℃退火45S,72℃延伸1min,15個(gè)循環(huán);72℃延伸10min,4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,之后用硝酸銀染色。1.4多帶型的標(biāo)記統(tǒng)計(jì)在親本之間產(chǎn)生多態(tài)性,并且在F2群體中有分離的條帶。記載原則是:抗病親本用A表示,感病親本用B表示。對(duì)于共顯性標(biāo)記,如果帶型和A相同,則記為1,如果帶型和B相同,則記為2,如果帶型為雜合型,則記為3,缺失帶型,則記為0;對(duì)于顯性標(biāo)記,如果B對(duì)A顯性,B帶型和F1帶型無法區(qū)別,將B帶型和F1帶型作為一種帶型,記為4,不出現(xiàn)帶型記為1。反之,如果A對(duì)B顯性,A帶型和F1帶型無法區(qū)別,將A帶型和F1帶型作為一種帶型,記為5,不出現(xiàn)帶型記為2。對(duì)所有F2單株帶型,共顯性標(biāo)記按孟德爾比例1∶2∶1,顯性標(biāo)記按3∶1進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。1.5分子標(biāo)記遺傳圖譜的建立圖譜構(gòu)建分析所用軟件為MAPMAKER/EXP3.0,用group命令(LOD≥3.0,重組率小于50)把所有標(biāo)記劃分為可能的連鎖群,用sequence選定后再用compare命令排序,最后用try命令確定個(gè)別標(biāo)記的位置,采用Kosambi函數(shù)將重組值轉(zhuǎn)換成圖距(cenntiMorgan,cM),確定相應(yīng)的連鎖群并依次建立分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜,并用MapDraw軟件將圖譜信息繪制成連鎖遺傳圖譜。2結(jié)果與分析2.1引物的篩選本試驗(yàn)共選用了95對(duì)SSR引物,篩選出兩親本15R和14S間表現(xiàn)多態(tài)性的引物60對(duì),多態(tài)性引物比例為63.2%,其中共顯性標(biāo)記55個(gè),顯性標(biāo)記5個(gè)。2.2孟德爾分離比例對(duì)引物的檢測(cè)利用60對(duì)SSR引物,對(duì)180個(gè)F2單株作圖群體進(jìn)行標(biāo)記基因型檢測(cè),對(duì)所有F2單株帶型按孟德爾分離比例,共顯性按1∶2∶1,顯性標(biāo)記按3∶1進(jìn)行χ2試驗(yàn)。51對(duì)引物的試驗(yàn)結(jié)果符合1∶2∶1結(jié)果,為共顯性標(biāo)記,4對(duì)引物的試驗(yàn)結(jié)果不符合1∶2∶1結(jié)果,偏離孟德爾分離比例,偏分離比率為6.7%。5對(duì)引物的試驗(yàn)結(jié)果符合3∶1結(jié)果,為顯性標(biāo)記(表1)。2.3藍(lán)藍(lán)染色體系與藍(lán)細(xì)胞標(biāo)記間的距離分布利用Mapmaker/Exp3.0進(jìn)行連鎖分析時(shí),其中有4個(gè)SSR標(biāo)記沒連鎖上。其余52個(gè)標(biāo)記分布于甘藍(lán)的9條染色體上,覆蓋甘藍(lán)基因組653.2cM,標(biāo)記間平均距離為12.56cM(圖1)。引物OL10-F06對(duì)F2作圖群體基因型檢測(cè)表現(xiàn)為共顯性(圖2),引物OL10-D03對(duì)F2作圖群體基因型檢測(cè)表現(xiàn)為顯性(圖3)。3遺傳圖譜的大小一般認(rèn)為,一個(gè)基本的染色體連鎖框架圖要求標(biāo)記間平均距離不大于20cM,如果構(gòu)建連鎖圖譜的目的是為了進(jìn)行主效基因定位,其平均距離要求在10～20cM或更小。用于QTL定位的連鎖其平均距離要求在10cM以下,如果為了基因克隆,則要求目標(biāo)區(qū)域標(biāo)記的平均距離在1cM以下。據(jù)報(bào)道B.olercea圖譜長(zhǎng)度一般在800～1100cM左右,本研究得到的甘藍(lán)遺傳圖譜總長(zhǎng)度為653.3cM,明顯小于Landry等(1112cM,201個(gè)標(biāo)記)和Camargo等(1002cM,112個(gè)標(biāo)記)利用亞種間F2代所構(gòu)建的圖譜。本研究所構(gòu)建的圖譜比Voorrips等(615cM,92個(gè)標(biāo)記)利用亞種間DH群體所構(gòu)建的圖譜長(zhǎng)度要長(zhǎng)。圖譜大小除與基因組大小有關(guān)外,尚與所用的群體種類有關(guān)。遺傳圖譜大小的差異反映了作圖群體雙親間遺傳差異的大小,當(dāng)雙親間遺傳距離大,差異位點(diǎn)多,且在染色上均勻分布時(shí),構(gòu)建的遺傳圖譜較長(zhǎng),更接近基因組實(shí)際大小。本研究為了獲得抗根腫病完整遺傳信息,所使用的雙親是15R和14S兩個(gè)結(jié)球甘藍(lán)栽培種