不同提取方法對(duì)總皂苷提取效果的影響

不同提取方法對(duì)總皂苷提取效果的影響

甜品袋，又名金藤，在《中國藥典》2010年版中收錄到該版本。這是百合科i類植物smilinfom根據(jù)不同的疾病，干燥的根，具有潤濕去除濁、祛風(fēng)除絡(luò)、解毒除濕等功效。廣泛用于婦科慢性炎癥、附件炎癥等疾病的治療。菝葜主要含有皂苷、黃酮、氨基酸及其他類化合物,其中皂苷為菝葜抗炎的主要活性成分之一。菝葜根莖內(nèi)的皂苷類成分通過糖基與纖維素結(jié)合而存在于細(xì)胞壁中,所以不容易被提取完全,本實(shí)驗(yàn)考慮到甾體皂苷的極性以及細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu),比較了酶解法、超臨界CO2流體萃取法同常規(guī)提取方法(加熱回流和滲漉)對(duì)菝葜藥材中總皂苷提取的影響,為菝葜藥材中總皂苷的質(zhì)量控制以及深層次的研究和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。1超臨界萃取儀UV—1601紫外分光光度儀,R501B星海旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,AS3120超聲儀,AB204—N十萬分之一天平,HA220—50—06超臨界萃取儀。薯蕷皂苷對(duì)照品(批號(hào)111707-200501)由中國藥品生物制品檢定所提供,聚酰胺(60~90目,江蘇臨江試劑化工廠),植物精提復(fù)合酶SPE-007(由纖維素酶和果膠酶組成,寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)),實(shí)驗(yàn)所用藥材購于河北安國藥材市場(chǎng),經(jīng)天津藥物研究院中藥現(xiàn)代研究部張鐵軍研究員鑒定為百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根莖,其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1樣品提取方法2.1.1加熱和回收水2.1.2乙醇的提取時(shí)間稱取菝葜藥材100g,置于圓底燒瓶中,60%乙醇為溶劑加熱回流提取3次,溶液用量分別為1000、800、800mL,提取時(shí)間分別為2.0、1.5、1.5h。抽濾,合并3次濾液。2.1.3復(fù)合酶的活化稱取菝葜藥材100g,置于圓底燒瓶中,加入600mL溫水(40℃)浸泡30min;取復(fù)合酶適量(藥材干質(zhì)量的0.5%)加入溫水(40℃)活化10min;待水浴溫度為50℃,pH值調(diào)至5時(shí),緩慢加入酶液并輕輕攪拌,恒溫酶解2.0h。濾過,藥渣加入60%乙醇加熱回流提取3次,同“2.1.2”項(xiàng)操作,抽濾,合并濾液。2.1.4滲句法g稱取菝葜藥材(粉碎后過20目篩)100g,60%乙醇作為滲漉溶劑(用量為藥材干質(zhì)量的20倍),以2.0mL/min的體積流量滲漉24h,收集滲漉液。2.1.5萃取反應(yīng)器加熱稱取菝葜藥材(粉碎后過40目篩)150g投入萃取釜中,95%乙醇作為夾帶劑,分別對(duì)萃取釜、分離釜進(jìn)行加熱,使萃取溫度為40℃,分離釜溫度為45℃,壓力為25MPa。當(dāng)溫度達(dá)到要求時(shí)開啟CO2鋼瓶,通過加壓泵對(duì)系統(tǒng)加壓,靜態(tài)提取1h,CO2循環(huán)提取1h,收集并合并萃取液。2.2總甾醇的測(cè)定2.2.1供試品溶液的制備精密吸取上述方法制備的不同提取液適量,蒸干,殘?jiān)犹崛∪軇┦谷芙?加于10g聚酰胺柱上端,70%乙醇洗脫收集洗脫液200mL,蒸干,加甲醇使溶解并轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中,甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得供試品溶液。2.2.3測(cè)定波長的確定分別精密量取薯蕷皂苷對(duì)照品溶液和供試品溶液各0.1mL,水浴揮干溶劑,加5mL高氯酸,搖勻,于70℃水浴加熱15min,取出,立即置冰水浴中冷卻2~3min,搖勻,以試劑作空白,在波長200~700nm進(jìn)行掃描,對(duì)照品溶液與供試品溶液均在405~409nm處有最大吸收,故選擇測(cè)定波長為407nm。2.2.4線性關(guān)系研究2.2.5精密度測(cè)試精密量取供試品溶液0.1mL,按“2.2.3”項(xiàng)方法顯色后,在407nm處重復(fù)測(cè)定A值6次,計(jì)算得其RSD為0.02%。2.2.6總皂苷檢測(cè)取同一批金剛藤藥材粉末6份,按“2.2.1”項(xiàng)操作制備供試品溶液,再按“2.2.3”項(xiàng)顯色后,在407nm處測(cè)定A值,并計(jì)算每份總皂苷的量,其RSD為3.22%。2.2.7rsd測(cè)定取同一供試品溶液,按“2.2.3”項(xiàng)顯色后,分別在0、5、10、15、20、25、30min時(shí)在407nm處測(cè)定A值,并計(jì)算其RSD為0.52%。2.2.9總皂苷的提取分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各0.1mL置具塞試管中,按“2.2.3”項(xiàng)方法顯色后在407nm處測(cè)定A值,計(jì)算不同提取方法所得菝葜提取物中總皂苷的量,計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)、轉(zhuǎn)移率和出膏率,結(jié)果見表1。3顯色劑和前處理?xiàng)l件的選擇從結(jié)果來看,加入復(fù)合酶并沒有達(dá)到預(yù)期提高菝葜總皂苷提取的效果,而是增大了出膏率,由此推測(cè),采用60%乙醇提取已經(jīng)能夠穿透細(xì)胞壁,酶的作用是進(jìn)一步破壞細(xì)胞壁,將高分子物質(zhì)降解為糊精、纖維二糖等,從而增大非指標(biāo)成分的溶出,引入了更多雜質(zhì)。超臨界CO2流體萃取法的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于其他提取方法,但轉(zhuǎn)移率很低,可見在提取過程中,造成了大量損失。而水加熱回流法和滲漉法無論是轉(zhuǎn)移率還是質(zhì)量分?jǐn)?shù)都小于醇加熱回流提取。因此,醇加熱回流的提取方法在菝葜的提取中是一種值得廣泛推廣的方法。在顯色劑的選擇上分別選用香草醛-冰醋酸和硫酸、香草醛-冰醋酸和高氯酸,在30min內(nèi)高氯酸相對(duì)前兩種顯色劑穩(wěn)定,因此選擇高氯酸作為顯色劑。菝葜紅色素是一種水溶性色素,從外觀來看,除超臨界提取液外,其他提取液中其量均較高,這直接影響了總皂苷定量測(cè)定的準(zhǔn)確性,因此,本實(shí)驗(yàn)分別采用了3種不同方法進(jìn)行前處理:直接過大孔吸附樹脂、水飽和正丁醇萃取氨試液除雜后過聚酰胺、直接過聚酰胺柱。結(jié)果表明,選用直接過聚酰胺柱的前處理方法制備的菝葜總皂苷樣品,與紅色素分離效果好、損失少,并且經(jīng)過全波長掃描,最大吸收出現(xiàn)在407nm附近。同時(shí)對(duì)未顯色的樣品進(jìn)行了全波長掃描,無干擾。因此菝葜提取物的預(yù)處理選擇直接過聚酰胺柱的方法。皂苷類化合物為菝葜中的主要成分之一,同時(shí)又是活性成分,如采用不當(dāng)?shù)臏y(cè)定方法會(huì)使結(jié)果偏離真實(shí)值,從而影響對(duì)菝葜質(zhì)量的真實(shí)評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)所建立的菝葜總皂苷定量測(cè)定方法,操作簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確性和精確性較高,為菝葜藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。稱取菝葜藥材100g,置于圓底燒瓶中,水加熱回流提取3次,溶劑用量分別為1000、800、800mL,提取時(shí)間分別為2.0、1.5、1.5h。抽濾,合并3次濾液。2.2.2儲(chǔ)備液的配制精密稱取薯蕷皂苷對(duì)照品10.31mg,置25mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,配成質(zhì)量濃度為412.4μg/mL的儲(chǔ)備液。分別精密量取薯蕷皂苷對(duì)照品儲(chǔ)備液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL,按“2.2.3”項(xiàng)方法顯色,在407nm處測(cè)定吸光度(A)值。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)、A值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程Y=16.618X-0.0086,r=0.9993,結(jié)果表明薯蕷皂苷在4.124~41.24μg/mL與A值具有良好線性關(guān)系。2.2.8加樣回收試驗(yàn)取已知總皂苷量(3.08%)的菝