鈣網(wǎng)蛋白n端氨基酸的克隆及原核表達(dá)

鈣網(wǎng)蛋白n端氨基酸的克隆及原核表達(dá)

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移取決于新血管的生成，提供足夠的血液，并從癌組織那里獲得必要的養(yǎng)分和氧氣。尋找高效、低毒血管生成的抑制因素，抑制腫瘤血管生成，是當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。在20世紀(jì)末，我們發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)內(nèi)源性血管生成的抑制因素，如aneistati、refine、costati和thoret。與傳統(tǒng)的抗癲癇藥物不同，這些抗癲癇藥物沒有具有抗藥性和很低的毒性，但這些蛋白質(zhì)因素的分子質(zhì)量高，不利于血管生成和實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的生長(zhǎng)。它可以作為一個(gè)重要的內(nèi)皮細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)和血管的生成。為了研究crt及其n區(qū)（1.180個(gè)氨基酸）的不同功能，發(fā)現(xiàn)了c-c1（137個(gè)氨基酸）和氨基c-c1（27個(gè)氨基酸）。鈣和中間的鉻酸鹽具有兩個(gè)重復(fù)序列的p區(qū)。為了研究crt及其n區(qū)（1.180個(gè)氨基酸），它可以單獨(dú)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和血管的生成。為了通過蛋白質(zhì)分析軟件對(duì)crtn段（1.180個(gè)氨基酸）的可能活動(dòng)功能進(jìn)行分析，并應(yīng)用pcr技術(shù)對(duì)crtn段（12280個(gè)氨基酸）的編碼權(quán)限進(jìn)行分析，以確定crtn段（n58）可用于牛仔布斯特。對(duì)桿狀骨。1材料和方法1.1材料表面1.1.1蘑菇和顆粒菌株E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)為本室保存,質(zhì)粒pET-3c由暨南大學(xué)生物工程中心轉(zhuǎn)贈(zèng).1.1.2患者細(xì)胞株鑒定海蘭種蛋由佛山畜牧有限公司供給;黑色素瘤細(xì)胞株(B16)、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)、人胚肺成纖維細(xì)胞株(HLF)、人乳腺癌細(xì)胞株(MCF-7);C57/BL小鼠,雄性,6～8周齡,體重18～20g購于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心.1.1.3試劑及pcr引物限制性內(nèi)切酶,T4DNA連接酶及其他限制性修飾酶購自GIBCO-BRL公司,dNTP、PCR試劑盒及DNA回收試劑盒為Roche公司產(chǎn)品.Tricine,MTT及IPTG購自Sigma公司,PCR引物由上海博亞公司合成,胎兒組織總cDNA購自Clontech公司.1.2方法1.2.1通過提取物質(zhì)和酶切dna、連接dna和轉(zhuǎn)化闡明竹腸菌按文獻(xiàn)方法進(jìn)行.1.2.2pcr擴(kuò)增crtn區(qū)的n65dna序列先從人胎肝總cDNA中用PCR擴(kuò)增人鈣網(wǎng)蛋白cDNA,然后以CRTcDNA為模板,通過PCR擴(kuò)增CRTN區(qū)的N58DNA序列.擴(kuò)增條件為第一循環(huán)94℃5min,60℃1min,72℃1min;第二循環(huán)開始每個(gè)循環(huán)94℃1min,60℃1min,72℃1min共30個(gè)循環(huán).PCR產(chǎn)物的DNA序列分析由博亞生物技術(shù)有限公司完成.1.2.3sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳sds-東南角將含N58DNA序列的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),在含氨芐青霉素(Amp)(100mg/L)的平板上篩選轉(zhuǎn)化子,挑取轉(zhuǎn)化子單菌落接種于含Amp(100mg/L)的2×YT培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,次日轉(zhuǎn)接至新鮮的2×YT培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至A600=0.5,加IPTG至終濃度為0.4mmol/L,繼續(xù)培養(yǎng)6h.取1ml培養(yǎng)液離心收集菌體,懸浮于40μlTE緩沖液,加等體積2×上樣緩沖液100℃煮沸5min,取10μl進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)分析.1.2.4sds-東南角分析菌體懸浮于STE中,用超聲波破碎,離心收集沉淀即為粗制包涵體.用含有0.05%TritonX-100的4mol/L尿素反復(fù)洗滌包涵體,除去細(xì)胞碎片、核酸等雜質(zhì).純凈的包涵體溶于變性液(50mmol/LTris,10mmol/LEDTA,8mol/L尿素,0.5%β-巰基乙醇)中,室溫下放置過夜進(jìn)行變性溶解.次日,離心除去不溶物質(zhì),上清液在磁力攪拌下緩慢加入20倍體積復(fù)性緩沖液(50mmol/LTris-1mmol/LEDTA-2mmol/L還原型谷胱甘肽-1mmol/L氧化型谷胱甘肽),室溫過夜進(jìn)行復(fù)性.復(fù)性液用MilliporeTFF超濾器濃縮并除去尿素等部分雜質(zhì).超濾液上SephadexG75層析柱(1.6cm×50cm),樣品4ml,用50mmol/L的pH8.0Tris-HCl平衡和洗脫,每管2ml,共收集20管,用考馬斯亮藍(lán)G250檢測(cè),含蛋白質(zhì)的管進(jìn)行SDS分析.1.2.5細(xì)胞活力試驗(yàn)rpmi-1330采用MTT法,實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均培養(yǎng)在含10%小牛血清,100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用0.25%的胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液,再用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為3×104～5×104個(gè)/ml.按0.1ml/孔細(xì)胞懸液的量加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板.按試驗(yàn)設(shè)計(jì)每組為3個(gè)重復(fù)孔,空白對(duì)照孔不加細(xì)胞,在37℃5%CO2中培養(yǎng)24h,更換新鮮培養(yǎng)液,試驗(yàn)組各加入0.05mlN58蛋白樣品,培養(yǎng)72h后,加入0.02mlMTT,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,吸去上清,加0.1mlDMSO,振蕩10min,測(cè)A570.1.2.6樣品制備和n65蛋白表達(dá)選用孵育6天的雞胚,以滅菌濾紙片(0.5mm×0.8mm)作為樣品載體,對(duì)照組(n=5)加入10μlPBS溶液,實(shí)驗(yàn)組(n=5)加10μl濃度為0.5g/L的N58蛋白樣品,培養(yǎng)48h觀察結(jié)果.1.2.7圖像見表1接種0.2ml細(xì)胞濃度為0.5×106個(gè)/ml的B16黑色素瘤細(xì)胞于C57BL/6小鼠的右前肢跟部上方.待瘤體長(zhǎng)出后用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑(L)和短徑(W),按公式V=1/2LW2計(jì)算瘤體積,單位mm3.待腫瘤長(zhǎng)至100mm3左右時(shí),將C57BL/6小鼠隨機(jī)分組:實(shí)驗(yàn)組(n=5)在靠近腫瘤部位皮下注射100μg(0.2ml)待測(cè)樣品;對(duì)照組(n=4)皮下注射0.2ml的PBS.每24小時(shí)重復(fù)注射一次,持續(xù)8天,觀察腫瘤生長(zhǎng)情況,測(cè)量腫瘤體積,然后取出腫瘤稱重,計(jì)算抑瘤率,2結(jié)果2.1n58敦a段的克隆2.1.1pcr索引的合成根據(jù)已發(fā)表的CRTcDNA的序列合成了如下兩對(duì)PCR引物.2.1.2pcr擴(kuò)增n65先以P1、P2為引物用PCR技術(shù)從人胎腦總cDNA中擴(kuò)增CRTcDNA,經(jīng)序列分析后克隆至pUC19的SacⅠ和XbaⅠ位點(diǎn),然后以CRTcDNA為模板,P3、P4為引物擴(kuò)增N58DNA片段.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,擴(kuò)增產(chǎn)物約為200bp(圖1),DNA序列分析結(jié)果如圖2.PCR產(chǎn)物大小為206bp,除去兩端的限制酶切位點(diǎn)和終止密碼,實(shí)際的編碼區(qū)為177bp,相當(dāng)于CRT的N端122～180位氨基酸(圖2).2.2質(zhì)粒pet-n65PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒純化和序列分析后,用NdeⅠ和BamHⅠ酶切后,與同樣經(jīng)過NdeⅠ和BamHⅠ酶切的質(zhì)粒pET-3c連接,獲得N58DNA的表達(dá)載體pET-N58(圖3).根據(jù)pET-3c圖譜和序列分析,pET-3c經(jīng)過XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切應(yīng)切出一條589bp的小帶,而重組質(zhì)粒pET-N58應(yīng)切出一條766bp的小帶,圖1顯示的結(jié)果與預(yù)期吻合.電泳與序列分析結(jié)果顯示N58DNA已克隆至質(zhì)粒pET-3c且連接部分的序列正確.2.3sds-東南角分析將重組質(zhì)粒pET-N58轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)后獲得的轉(zhuǎn)化子E.coliBL21(DE3,pET-N58)在2×YT培養(yǎng)液培養(yǎng)至A600約為0.5時(shí)加IPTG誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS.圖4結(jié)果顯示,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)6h后,E.coliBL21(DE3,pET-N58)泳道上在6.2ku附近出現(xiàn)一條新的蛋白質(zhì)帶,而未經(jīng)誘導(dǎo)的BL21(DE3,pET-N58)和經(jīng)誘導(dǎo)的BL21(DE3,pET-3c)泳道上不出現(xiàn)相應(yīng)的帶.用薄層激光掃描儀進(jìn)行掃描分析,估算出N58的表達(dá)量約占菌體總蛋白的35.4%.SDS結(jié)果還顯示,菌體經(jīng)超聲破碎后,目標(biāo)蛋白主要集中在沉淀部分,以包涵體的形式存在.2.4超濾濃縮法分離目標(biāo)蛋白超聲破菌后收集的包涵體經(jīng)洗滌液Ⅰ,Ⅱ反復(fù)洗滌后,溶解于8mol/L尿素中,然后稀釋于20倍體積的復(fù)性液中復(fù)性,得到的復(fù)性產(chǎn)物經(jīng)超濾濃縮后,上SephadexG75層析柱純化蛋白質(zhì)樣品.經(jīng)純化后的目標(biāo)蛋白純度達(dá)到91.5%(圖5).2.5重組n54蛋白對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響本實(shí)驗(yàn)用50mg/L和0.5mg/L的重組N58蛋白作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)及B16黑色素瘤細(xì)胞、人胚肺成纖維細(xì)胞HLF和人乳腺癌細(xì)胞MCF-7等3種非內(nèi)皮細(xì)胞,用MTT比色法測(cè)定A570,并計(jì)算抑制率.圖6結(jié)果顯示0.5mg/L濃度的重組N58蛋白即能抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(ECV304)的生長(zhǎng).抑制率為74.28%,50mg/L濃度時(shí)抑制率上升至85.52%.而重組N58蛋白對(duì)3種非內(nèi)皮細(xì)胞的抑制率都很低.可見重組N58蛋白能專一地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,而對(duì)非內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯的抑制作用.2.6雞胚血管稀疏表達(dá)產(chǎn)物n65蛋白表達(dá)的雞胚血管稀疏率,雞胚血管稀疏自由基因型md5蛋白表達(dá)對(duì)cmp血管初始蛋白表達(dá)的影響,總蛋白n65蛋白表達(dá)的蛋白表達(dá)按1.2.6的方法測(cè)定N58蛋白的抗血管生成作用,從圖7可見,經(jīng)N58蛋白處理的實(shí)驗(yàn)組雞胚血管稀疏,與對(duì)照組比較分支明顯減少,說明表達(dá)產(chǎn)物N58蛋白具有抑制CAM血管生成的作用.2.7天后平均瘤體積、瘤體重的變化按1.2.7的方法進(jìn)行抑瘤活性分析,圖8及表1的結(jié)果顯示,注射PBS的對(duì)照組小鼠黑色素瘤迅速生長(zhǎng),8天后平均瘤體積達(dá)到(1970±546)mm3,而經(jīng)重組N58蛋白處理的試驗(yàn)小鼠黑色素瘤生長(zhǎng)受到抑制,其平均瘤體積僅為(470±90)mm3(P<0.05).將小鼠處死,剝下瘤體稱重,發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠平均瘤體重為(1.720±0.49)g,實(shí)驗(yàn)組平均瘤體重為(0.56±0.12)g,抑瘤率為71.4%.3n65蛋白在腫瘤治療中的作用本文應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增編碼鈣網(wǎng)蛋白N端第122～180位氨基酸(N58)的DNA片段,實(shí)現(xiàn)了其在大腸桿菌中的高效表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物在體外能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,在體內(nèi)抑制新生血管的生成,并能阻止實(shí)驗(yàn)性腫瘤的生長(zhǎng).N58蛋白的這些生物學(xué)活性與Pike等報(bào)道的N端第1～180位氨基酸片段的生物學(xué)活性相似.如本文用100μg/d劑量的N58蛋白樣品,與Pike等用100μg/d劑量的N端第1～180位氨基酸片段樣品處理荷瘤小鼠其抑制腫瘤的效果相似.鈣網(wǎng)蛋白的抗血管生成活性區(qū)是否就在122～180位氨基酸片段或更小的片段,正在進(jìn)一步研究中.與已發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子,如Angiostatin、Endostatin、Restin、Arestin等相比,N58蛋白是一個(gè)很小的的可溶性分子,它的分子質(zhì)量只有6ku左右,是迄今已報(bào)道的最小血管生成抑制因子,而且生物活性穩(wěn)定,易于重組蛋白的制備和藥物的傳輸.另外,本研究用100μg/d相當(dāng)于5mg/(kg·d)的劑量處理實(shí)驗(yàn)小鼠就能有效抑