中華絨螯蟹血淋巴液電鏡制樣技術(shù)改進(jìn)

中華絨螯蟹血淋巴液電鏡制樣技術(shù)改進(jìn)

血淋細(xì)胞的種類和數(shù)量與動(dòng)物的生理狀態(tài)和免疫功能密切相關(guān)。了解血淋細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能對(duì)理論和實(shí)踐具有重要意義。目前,在該領(lǐng)域內(nèi),國(guó)外研究的對(duì)象主要集中于海產(chǎn)種類;國(guó)內(nèi)有關(guān)蝦類血淋巴細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能也有一些報(bào)道,而關(guān)于中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)血淋巴細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)僅成永旭等進(jìn)行了報(bào)道,但只觀察到粒性細(xì)胞。本文作者在研究的中華絨螯蟹中發(fā)現(xiàn)3種類型血淋巴細(xì)胞,并對(duì)其超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和功能進(jìn)行研究和探討,旨在了解這3類細(xì)胞在河蟹機(jī)體中的作用和功能。1透射電鏡觀察血淋巴和血淋巴中華絨螯蟹103只,分別取自江蘇蘇州東山、淮陰、常州、宜興等地河蟹養(yǎng)殖場(chǎng),體重30~100g。用75%酒精體表消毒后,從基部截?cái)嗟?對(duì)步足,使血淋巴自動(dòng)滴于干凈的載玻片上,待血淋巴凝固后放入4%戊二醛中固定12h,用0.3mol/L磷酸緩沖液(pH7.3)清洗3次,將凝聚的血塊切成0.5~1.0mm3小塊,用1%鋨酸固定2h,再用磷酸緩沖液清洗3次,丙酮梯度脫水,Epon812環(huán)氧樹(shù)酯包埋,Reichert-Jung超薄切片機(jī)超薄切片,厚度50~80nm,醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色,日立H-600透射電鏡觀察并照像。2結(jié)果根據(jù)透射電鏡觀察結(jié)果,中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞可分為3類(圖版Ⅰ-1)。2.1核型mds-n/c見(jiàn)圖版Ⅰ-2。細(xì)胞呈球形,數(shù)目最多,直徑5.6~7.2μm,胞質(zhì)中無(wú)顆粒,核質(zhì)比(N/C)最大,約3/5,核呈球形,居中,幾乎占滿整個(gè)細(xì)胞,核內(nèi)幾乎無(wú)常染色質(zhì)分布,異染色質(zhì)高度濃縮且邊緣化,分布于核膜內(nèi)側(cè),核周腔擴(kuò)大;胞質(zhì)很少,只有薄薄一層,但線粒體相對(duì)較多,其余細(xì)胞器較少,有核糖體和少量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)。2.2電子致密顆粒見(jiàn)圖版Ⅰ-3。細(xì)胞呈不規(guī)則卵圓形,短徑5.2~7.0μm,長(zhǎng)徑8.0~10.2μm,外周常伸出偽足,胞質(zhì)中含有圓形或卵圓形的電子致密顆粒,短徑0.1~0.2μm,長(zhǎng)徑0.3~0.4μm。有的細(xì)胞中顆粒少而分散,有的細(xì)胞中顆粒多且分布均勻。其核質(zhì)比(N/C)介于無(wú)顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞之間,約1/6,核卵圓形或腎形,常位于細(xì)胞一側(cè)。核內(nèi)常染色質(zhì)較多,異染色質(zhì)分布均勻,胞質(zhì)中有許多大小不一的空泡,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體發(fā)達(dá)。2.3電子致密顆粒的制備細(xì)胞呈卵圓形,短徑6.2~8.4μm,長(zhǎng)徑9.2~12.4μm,在3類細(xì)胞中體積最大,邊緣不規(guī)則,也常見(jiàn)偽足。胞質(zhì)中有較大的圓形電子致密顆粒,直徑1.4~2.0μm,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于小顆粒細(xì)胞中的顆粒,數(shù)目因不同細(xì)胞而異。其核質(zhì)比(N/C)最小,約1/10,核腎形,偏向細(xì)胞一側(cè),胞質(zhì)中細(xì)胞器較少,有較大的空泡(圖版Ⅰ-4)。3討論與分析3.1無(wú)份細(xì)胞的數(shù)目在有關(guān)中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的報(bào)道中,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)非粒性細(xì)胞,可能是由于粒性細(xì)胞和非粒性細(xì)胞的比重不同,在離心過(guò)程中被分開(kāi)。本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行離心處理,直接取血淋巴液固定、脫水、包埋,所以不會(huì)因離心提取而丟失血細(xì)胞成分,因而發(fā)現(xiàn)無(wú)顆粒細(xì)胞的數(shù)目較多(圖版Ⅰ-2)。常規(guī)制做電鏡觀察的血細(xì)胞樣品需離心處理,并用瓊脂預(yù)包埋,目的是為了收集血細(xì)胞并將其凝聚在一起。而中華絨螯蟹血淋巴極易凝固,不需再用瓊脂將其凝集在一起。本實(shí)驗(yàn)利用這一特點(diǎn),不進(jìn)行預(yù)包埋,也不用離心處理,而是直接雙固定,避免了制樣過(guò)程中對(duì)血細(xì)胞的人為破壞和遺失。用此方法在3年時(shí)間里分別對(duì)11批樣品進(jìn)行了處理,其結(jié)果顯示一致,表明該方法具有可靠的重復(fù)性,是蟹類血細(xì)胞電鏡制樣的有效方法。用改進(jìn)方法制出的樣品,雖然細(xì)胞密度不高,但能較真實(shí)地再現(xiàn)各類血細(xì)胞的分布情況。本電鏡觀察的結(jié)果中,血細(xì)胞的種類及各類細(xì)胞的數(shù)量基本與我們血涂片的光鏡觀察結(jié)果以及在組織中(如鰓、心肌、結(jié)締組織等)的電鏡觀察結(jié)果相同。3.2種細(xì)胞的功能目前,對(duì)甲殼動(dòng)物血淋巴細(xì)胞分類與命名的一般依據(jù)是血細(xì)胞胞質(zhì)中顆粒的有無(wú),顆粒的多少以及顆粒的大小。其命名大致分為:無(wú)顆粒細(xì)胞/透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞/半顆粒細(xì)胞、大顆粒細(xì)胞/顆粒細(xì)胞。依照于建平對(duì)血細(xì)胞的分類,本文將中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞分為3類,即無(wú)顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞(圖版Ⅰ-1)。根據(jù)無(wú)顆粒細(xì)胞的形態(tài)特征分析,它的細(xì)胞核內(nèi)基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄初產(chǎn)物的加工等功能很微弱,這與高等動(dòng)物的中幼紅細(xì)胞結(jié)構(gòu)很相似。而該細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)目相對(duì)較多,推斷其可能承擔(dān)一種耗能較多的生理機(jī)能,如物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝等。此外,該細(xì)胞數(shù)目在中華絨螯蟹血淋巴中最多,它們可能擔(dān)負(fù)著血液的能量轉(zhuǎn)換功能。小顆粒細(xì)胞表面有許多偽足樣突起,可能具有運(yùn)動(dòng)和吞噬能力。該細(xì)胞核內(nèi)常染色質(zhì)較多,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體發(fā)達(dá),表明細(xì)胞合成代謝活躍(圖版Ⅰ-3)。胞質(zhì)中存在電子致密顆粒,而且有許多大小不一的空泡,分布于胞質(zhì)周邊。上述特征均類似高等動(dòng)物的單核細(xì)胞,因而其內(nèi)部顆?？赡芫哂谐跫?jí)溶酶體的功能,可吞噬和消化異物,在機(jī)體免疫中起重要作用。大顆粒細(xì)胞也有偽足樣突起,可能也具有運(yùn)動(dòng)或吞噬能力。其結(jié)構(gòu)特征與高等動(dòng)物血液中的嗜酸性粒細(xì)胞很相近,可能也具有吞噬、殺菌能力。對(duì)于小顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)的空泡,Cohen認(rèn)為它是胞吐作用后留下的胞斑(Exocytoticdomain)?？傊?中華絨螯蟹血淋巴的3種細(xì)胞具有各自特有的功能,