擬南芥和煙草對(duì)甲醛脅迫的fir分析

擬南芥和煙草對(duì)甲醛脅迫的fir分析

甲醛代謝途徑甲醇是植物碳軌跡的重要中間產(chǎn)物。通過(guò)處理5、10-亞甲基四羥基苯甲酸、氧化反應(yīng)和脫甲基環(huán)酸反應(yīng)產(chǎn)生的甲醛。高等植物都有代謝外源甲醛的能力,Giese等發(fā)現(xiàn)掛蘭(ChlorophtumcomosumL)的嫩芽置于7.1μL·L-1(8.5mg·m-3)14C標(biāo)記的氣體甲醛中超過(guò)24h后,回收的放射性中大約88%和植物結(jié)合,并被整合進(jìn)入有機(jī)酸、氨基酸、游離的糖分、脂質(zhì)和細(xì)胞壁成分中。據(jù)推測(cè)植物中甲醛的代謝可能通過(guò)一碳(C1)代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行,代謝途徑可能是:(1)甲醛(HCHO)被吸收進(jìn)植物體后可能會(huì)與四氫葉酸(Tetrahydrofolate,THF)形成加合物5,10-亞甲基-四氫葉酸(5,10-CH2-THF),然后由絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶催化參與絲氨酸的合成,或通過(guò)其他代謝途徑參與泛酸或胸腺嘧啶的合成;(2)5,10-CH2-THF可能也會(huì)經(jīng)由5,10-亞甲基-四氫葉酸脫氫酶/5,10甲川-四氫葉酸環(huán)化水解酶(5,10-Methylene-THFdehydrogenase/5,10-Methenyl-THFcyclohydrolase,MTD/MTC)和10-甲酰-四氫葉酸脫甲基酶的作用形成甲酸(HCOOH)。(3)5,10-CH2-THF可能也會(huì)經(jīng)由5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶被轉(zhuǎn)化為5-甲基-四氫葉酸(5-CH3-THF),參與甲硫氨酸或腺嘌呤的合成。(4)HCHO也可能會(huì)和谷胱甘肽形成加合物-羥甲基谷胱甘肽,然后由谷胱甘肽依賴(lài)型的甲醛脫氫酶催化形成甲?；入赘孰?再被S-甲酰谷胱甘肽水解酶水解為HCOOH。HCOOH最后被甲酸脫氫酶氧化為CO2和H2O,CO2又通過(guò)開(kāi)爾文循環(huán)同化為各種糖類(lèi)化合物,用這些糖類(lèi)化合物可合成細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)成分如淀粉、細(xì)胞壁中的纖維素等。(5)HCOOH也可能會(huì)由10-甲酰-四氫葉酸合成酶和MTD/MTC催化的可逆反應(yīng)轉(zhuǎn)化為5,10-CH2-THF,然后參與絲氨酸或泛酸或胸腺嘧啶的合成。(6)通過(guò)(1)～(5)途徑產(chǎn)生的氨基酸如絲氨酸和甲硫氨酸等可用于蛋白質(zhì)的合成。另外通過(guò)這幾條途徑合成的嘌呤和嘧啶可用于核酸的合成。以上的幾種甲醛代謝途徑在不同植物中的作用可能不同,它們起作用的時(shí)間順序可能也不一樣。擬南芥和煙草是植物學(xué)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的模式材料,對(duì)二者甲醛代謝機(jī)理的研究可以為探索其他高等植物甲醛代謝提供理論參考。本研究運(yùn)用FTIR技術(shù)分析擬南芥和煙草在甲醛脅迫條件下體內(nèi)全部物質(zhì)含量的變化規(guī)律及二者的光譜表征,為推定兩種植物甲醛代謝終產(chǎn)物和甲醛代謝機(jī)理提供重要線(xiàn)索,為證實(shí)二者甲醛代謝能力的差異提供證據(jù)。1材料和方法1.1煙草和columinia擬南芥(Arabidopsisthaliana,ecotype,columbia)和煙草(Nicotianatabacumcv.Xanth)種子經(jīng)表面消毒,播種在MS培養(yǎng)基中,長(zhǎng)大后用于甲醛吸收和代謝及FTIR分析。1.2方法1.2.1殘留甲醛的測(cè)定取5g植物材料放入三角瓶中,加入200mL的甲醛處理液(2mmol·L-1HCHO,5mmol·L-1KHCO3和0.1%MES),23℃持續(xù)光照振蕩培養(yǎng),處理不同時(shí)間后用Nash法測(cè)定處理液中殘留甲醛的濃度。另取0.4～2.0g植物材料浸泡于10～40mL甲醛處理液(2mmol·L-1HCHO,2μCiH14CHO,5mmol·L-1KHCO3,0.1%MES)中,23℃持續(xù)光照振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,用10%三氯乙酸(TCA)抽提并離心得到植物可溶性部分(上清液)和不溶性部分(殘?jiān)?,不溶性部分連續(xù)使用5%TCA洗1次,50%乙醇洗2次,100%乙醇洗1次。用液閃儀測(cè)定上清液和殘?jiān)?4C同位素活性,并計(jì)算出其占起始同位素14C活性的百分比。1.2.2樣品預(yù)處理和膜制備取5g植物材料放入2mmol·L-1甲醛處理液(200mL)中,23℃持續(xù)光照振蕩培養(yǎng)。在處理不同時(shí)間后取出植物樣品,用清水洗去表面殘留甲醛,105℃殺青,64℃烘箱干燥24h,磨成粉狀200目過(guò)篩。置于50℃烘箱中烘至恒重,準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00mg樣本,混入200.00mg碎晶型KBr于瑪瑙研缽中充分研磨,全部轉(zhuǎn)移到模具中用壓片機(jī)制備出均勻、透明錠片。每個(gè)處理樣本制備3個(gè)錠片,于傅里葉變換紅外光譜儀上采集譜圖。1.2.3樣品采集和圖譜的采集NicoletFTIR-5700傅里葉變換紅外光譜儀,DTGS檢測(cè)器,掃描范圍4000～400cm-1,分辨率為4cm-1,掃描累加32次。每個(gè)錠片選取3個(gè)點(diǎn)采集3張譜圖,取其平均譜圖作為最后的樣品譜圖。應(yīng)用OMNICE.S.P.5.1智能操作軟件進(jìn)行譜圖數(shù)據(jù)處理。每個(gè)樣品測(cè)定前均對(duì)背景進(jìn)行掃描,得到的紅外光譜進(jìn)行基線(xiàn)校正,確定峰值和吸光度。2結(jié)果與討論2.1對(duì)植物甲醛代謝的影響圖1(a)顯示擬南芥、煙草在2mmol·L-1甲醛處理液中吸收甲醛的速率。擬南芥完全吸收處理液中所有甲醛需36個(gè)h,但煙草樣品需要處理到48h才檢測(cè)不到殘留甲醛,由此可以看出兩種植物均能夠吸收處理液中的甲醛,但擬南芥的甲醛吸收能力要強(qiáng)于煙草。用放射性甲醛(H14CHO)處理植物后,在植物的可溶性部分(代謝中間產(chǎn)物)和不溶性部分(代謝終產(chǎn)物)均有14C活性出現(xiàn),但前者強(qiáng)度僅為后者的1/5(圖1(b)),這說(shuō)明甲醛在植物體內(nèi)主要被固定成不溶性組分,固定能力的強(qiáng)弱是影響植物甲醛代謝能力的主要因素。擬南芥不溶性部分中回收的14C活性是9.5%,而煙草為6.2%,這表明前者的甲醛固定能力要優(yōu)于后者。圖1(c)顯示擬南芥、煙草在2mmol·L-1甲醛處理不同天數(shù)后葉片顏色和形態(tài)的變化。在甲醛處理后第3天,煙草的葉片上開(kāi)始出現(xiàn)透明區(qū)域或白斑,至第4天,煙草葉片上出現(xiàn)較大面積的透明區(qū)和壞死區(qū),但是擬南芥葉片在甲醛處理后的第3天至第4天都沒(méi)有發(fā)生任何可見(jiàn)的變化或損傷。這說(shuō)明擬南芥葉片對(duì)甲醛的抗性比煙草強(qiáng)。2.2甲醛差異的理論依據(jù)和線(xiàn)索根據(jù)上述結(jié)果可推測(cè)擬南芥的甲醛代謝能力要強(qiáng)于煙草,但具體機(jī)制仍然未知。因此可用FTIR技術(shù)研究二者具體的甲醛響應(yīng)模式,為闡明這種差異提供理論依據(jù)和線(xiàn)索。圖2為擬南芥和煙草的FTIR圖譜,二者光譜特征基本相似,但分別有各自特異的吸收峰,二者主要的光譜特征峰歸屬如表1所示,其中1376cm-1左右的吸收峰僅出現(xiàn)在擬南芥樣品中,而1318cm-1左右的吸收峰僅出現(xiàn)在煙草樣品中。2.3擬南基肥中甲醛的代謝圖3是擬南芥經(jīng)2mmol·L-1甲醛處理后紅外光譜[圖3(a)]及其特征峰強(qiáng)度變化趨勢(shì)[圖3(b)]。甲醛在體內(nèi)是一種非常活潑的化合物,它本身反應(yīng)能力極強(qiáng),能與蛋白質(zhì),核酸和脂類(lèi)等產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)。此外,甲醛的氧化產(chǎn)物甲酰基谷胱甘肽在胞內(nèi)的過(guò)度積累可能導(dǎo)致光氧化過(guò)程,嚴(yán)重破壞葉綠體的結(jié)構(gòu),造成葉片萎黃。在用甲醛處理的擬南芥樣品中,所有吸收峰的強(qiáng)度值基本呈現(xiàn)先下降后上升恢復(fù)至甲醛處理前水平。在甲醛處理1天時(shí),大量外源甲醛被吸收進(jìn)細(xì)胞內(nèi)[圖1(a)],產(chǎn)生了劇烈的脅迫效應(yīng),導(dǎo)致蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)等生物大分子含量嚴(yán)重下降,紅外光譜中所有吸收峰的強(qiáng)度值與對(duì)照相比明顯降低,處于所有時(shí)間點(diǎn)中的最低水平。3,5,7天時(shí),吸收峰的強(qiáng)度值逐漸回升至對(duì)照水平,即一系列體內(nèi)大分子含量恢復(fù)到正常水平,這也顯示擬南芥細(xì)胞代謝活動(dòng)的正常化。由吸收曲線(xiàn)可知擬南芥在36h即完全吸收處理液中所有甲醛[圖1(a)],而此刻胞內(nèi)甲醛濃度可能沒(méi)有達(dá)到擬南芥所能耐受的閥值,因此在3天時(shí),細(xì)胞已經(jīng)從嚴(yán)重的脅迫中部分恢復(fù),至7天時(shí)其代謝活動(dòng)已經(jīng)和對(duì)照基本一致。與上述變化模式不盡一致的是1376cm-1附近的吸收峰,它是纖維素中甲基的伸縮振動(dòng)吸收峰,僅出現(xiàn)在擬南芥中。如圖3(b)所示,它的強(qiáng)度值在第1天時(shí)僅有一個(gè)輕微下降,在3天時(shí)迅速恢復(fù)到對(duì)照水平,在5天時(shí)繼續(xù)上升到最高處,7天時(shí)回落至對(duì)照水平?？赏茰y(cè)甲醛處理開(kāi)始時(shí)(第一天),吸收到擬南芥葉片內(nèi)的大量甲醛應(yīng)該流向由甲醛氧化到甲酸和CO2的代謝途徑(谷胱甘肽依賴(lài)途徑)。該途徑的主要步驟為:甲醛(HCHO)S-羥甲基谷胱甘肽→S-甲酰谷胱甘肽→甲酸(HCOOH)→CO2+H2O。由此途徑產(chǎn)生大量的甲酸,大量的甲酸被氧化生成CO2后進(jìn)入卡爾文循環(huán),用于糖類(lèi)物質(zhì)的合成,進(jìn)而導(dǎo)致纖維素含量上升比其他物質(zhì)快,所以1376cm-1附近的吸收峰在甲醛處理后第一天下降的趨勢(shì)不明顯。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),吸收的甲醛量加大,甲醛通過(guò)C1代謝網(wǎng)絡(luò)流向生成氨基酸到蛋白質(zhì)或核苷酸到核酸及其他物質(zhì)的量也逐漸增加,所以后來(lái)其他物質(zhì)的含量也慢慢恢復(fù)琢正常水平,這也可能是導(dǎo)致14C同位素示蹤實(shí)驗(yàn)中從擬南芥回收的不溶性部分有很高的14C活性的原因。依賴(lài)于谷胱甘肽的甲醛脫氫酶(FALDH)在植物中有高水平的表達(dá),并對(duì)S-羥甲基谷胱甘肽具有高親和力(Km:1.413μmol·L-1)。S-甲酰谷胱甘肽水解酶活性也已經(jīng)在植物中檢測(cè)到,DNA芯片分析證據(jù)說(shuō)明這種酶在植物中的表達(dá)水平也較高。Achkor等的研究表明在擬南芥中過(guò)量表達(dá)FALDH,可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥吸收甲醛的能力和對(duì)甲醛的耐性。FALDH表達(dá)量的減少降低轉(zhuǎn)基因擬南芥吸收甲醛的能力和對(duì)甲醛的耐性。因此目前普遍認(rèn)為以上2種酶組成的由甲醛氧化到甲酸的代謝途徑可能是擬南芥代謝甲醛的主要途徑。Ambard-Bretteville等的研究也證實(shí)用H13CHO處理馬鈴薯葉片后,在植物葉片中會(huì)有大量的13CO2釋放出來(lái)。有研究表明在光照條件下,二氧化碳含量顯著減少時(shí)給水稻噴施甲酸可以觀(guān)察到外源甲酸被快速吸收,通過(guò)甲酸脫氫酶氧化作用快速釋放二氧化碳可增加光合碳的可用性。到第5天,1376cm-1附近的吸收峰含量下降,而其他物質(zhì)的峰仍然上升,這可能是由于該途徑中的一些酶基因的表達(dá)受甲醛脅迫的抑制,而其他代謝途徑上的酶基因表達(dá)不受甲醛脅迫的影響,使甲醛的代謝流向該途徑迅速減少而向其他途徑的流量增加的結(jié)果。2.4甲醛對(duì)煙草細(xì)胞的代謝與擬南芥樣品相似,煙草樣品中各吸收峰的強(qiáng)度值也在第一天下降,然后緩慢上升(圖3)。不同的是,煙草樣品吸收峰的強(qiáng)度值最終沒(méi)有恢復(fù)至對(duì)照水平,在第4天時(shí)再次下降,而此時(shí)處理液中煙草葉片出現(xiàn)透明化現(xiàn)象,并開(kāi)始腐爛。大量甲醛被吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起蛋白質(zhì)、核酸、脂類(lèi)等大分子含量下降,在1天時(shí)所有吸收峰的強(qiáng)度值急劇下降。由于36h后煙草樣品中甲醛濃度已經(jīng)較低,在2天時(shí)已經(jīng)完全檢測(cè)不到[圖1(a)],所以吸收峰的強(qiáng)度在2和3天時(shí)有一定程度的回升,回升的幅度沒(méi)有達(dá)到處理前的水平,可能是由于甲醛脅迫對(duì)細(xì)胞代謝的影響依然持續(xù)。甲醛對(duì)煙草細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的損害是不可逆的,且比擬南芥嚴(yán)重,這可能直接反應(yīng)了二者甲醛代謝能力的差異,這也可能是導(dǎo)致14C同位素示蹤實(shí)驗(yàn)中煙草不溶性部分回收的放射性活力低于擬南芥的原因[圖1(b)]。至第4天時(shí)細(xì)胞已經(jīng)大量破碎,導(dǎo)致各吸收峰強(qiáng)度值的迅速下降,這些數(shù)據(jù)也能反映煙草對(duì)甲醛的抗性不如擬南芥強(qiáng)。煙草樣品特異性的1318cm-1吸收峰表現(xiàn)出與其他吸收峰一致的變化趨勢(shì)[圖3(d)],這說(shuō)明甲醛被吸收進(jìn)煙草細(xì)胞后,進(jìn)入C1代謝網(wǎng)絡(luò)各代謝途徑的流量差別可能不大,因此細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)的含量上升的速度是一致的。3煙草甲醛代謝的特性(1)通過(guò)甲醛吸收曲線(xiàn)分析和甲醛脅迫后葉片外觀(guān)形態(tài)的變化及14C同位素示蹤研究表明,擬南芥的甲醛吸收速率和甲醛抗性及甲醛代謝能力均強(qiáng)于煙草。(2)紅外光譜分析表明甲醛脅迫下擬南芥的化學(xué)成分沒(méi)有發(fā)生變化,但各化學(xué)成分的含量發(fā)生改變。擬南芥紅外光譜中1376cm-1附近的纖維素甲基伸縮振動(dòng)峰沒(méi)有出現(xiàn)在煙草樣品中,用甲醛處理擬南芥后它的變化趨勢(shì)與其他吸收峰不同(在甲醛脅迫開(kāi)始時(shí)僅有一個(gè)輕微的下降)。該吸收峰含量的變化趨勢(shì)可能是擬南芥和煙草甲醛代謝機(jī)理差異的主要表征,它反映甲醛脅迫開(kāi)始時(shí),