納米羥基磷灰石細菌纖維素復合材料的細胞相容性

納米羥基磷灰石細菌纖維素復合材料的細胞相容性

0生物材料的特性納米羥基磷灰石（nhap）是天然骨骼中礦化基質(zhì)的主要成分，具有良好的生物性能，但具有低強度、低耐候性，限制了特定部位骨缺損修復的應用。細菌纖維（bc）是一種天然生物材料。它具有良好的生物活性、生物可分解性和生物適應性，并具有獨特的物理、化學和機械機械。例如，高結晶、高透水、多孔納米纖維網(wǎng)絡、高耐張力、彈性模型等。Wan等結合這兩種材料的特性,制備了nHAP/BC復合物。該材料的結構特征類似于骨骼中的生物磷灰石,不僅具有足夠的強度,還具有骨傳導功能,以滿足骨細胞在支架上的黏附和繁殖,成為一種很有前途的骨組織工程納米支架材料。生物相容性是指生物材料和人體組織接觸后,在材料-組織界面發(fā)生一系列相互作用后最終被人體組織所接受的性能,生物材料對宿主細胞的生長影響,一直是評價生物材料生物相容性的關鍵性指標之一。本文使用生物學評價中首選的體外篩選實驗——細胞毒性實驗,并采用流式細胞儀從DNA合成周期角度評價nHAP/BC復合材料及其降解產(chǎn)物對成骨細胞的相容性。1細胞毒性檢測設計:體外細胞學實驗。時間及地點:于2009-03/05在中國藥品生物制品檢定所醫(yī)療器械中心及細胞室完成。材料:材料的降解:天津大學萬怡灶等將nHAP沉積在BC納米纖維絲上制成復合支架nHAP/BC。陳艷梅對nHAP/BC復合材料在纖維素酶中的降解過程及降解后產(chǎn)物的理化性質(zhì)進行了詳細研究。將nHAP/BC材料制成大小為1cm×1.5cm的小塊。每塊材料放入裝有45mL纖維素酶的容器中,將容器放入50℃恒溫箱中分別降解1,3,10h。每個時間點4個復樣。然后倒掉原液,用SDS清洗兩遍,再用雙蒸水清洗數(shù)遍后用PBS浸泡過夜。將原材料nHAP/BC及降解1,3,10h后的材料分別制成2mm×2mm及1cm×1.5cm的小塊數(shù)個,高壓滅菌。細胞毒性的檢測:(1)將第4代處于對數(shù)生長末期的成骨細胞用胰酶消化離心后吹打成細胞懸液,調(diào)整細胞密度為5×107L-1,均勻接種到2個96孔板內(nèi),每孔100μL。(2)將孔板放入(37±2)℃、含體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(3)2d后,每孔都換新鮮的培養(yǎng)液(含體積分數(shù)為10%胎牛血清),并將nHAP/BC及其降解后的材料(2mm×2mm)輕輕的放置于每個孔中央部位的細胞層上,每種材料4個復孔。(4)同法制備陰性對照(高密度聚乙烯),陽性對照(5%二甲基亞砜),并以100%培養(yǎng)液做空白對照組。(5)在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng),且每日在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、生長及增殖情況。(6)分別于第2,4天各取96孔板1塊,按20μL/孔,加入5g/L的MTT溶液并放培養(yǎng)箱繼續(xù)孕育4h后,吸出原液,用PBS清洗1遍,吸棄孔內(nèi)液后,每孔加150μL二甲基亞砜,用微量振蕩儀輕輕振蕩10min使其充分溶解后,用酶聯(lián)免疫檢測儀在檢測波長為570nm,參比波長為630nm條件下測定各孔吸光度值(A值),計算每組平均A值。(7)根據(jù)公式計算細胞相對增殖率(RGR),細胞毒性評級標準參考ISO-10993-5細胞毒性試驗。RGR(%)=(實驗組平均A值/空白對照組平均A值)×100%。細胞毒性評級標準:細胞周期的測定:(1)將處于對數(shù)生長末期的成骨細胞用胰酶消化離心后吹打成細胞懸液,均勻接種到1cm×25cm的小培養(yǎng)瓶中,每組4個復樣。(2)將培養(yǎng)瓶放入(37±2)℃、含體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(3)1d后,每個培養(yǎng)瓶都換新鮮的培養(yǎng)液,并將nHAP/BC及其降解后的材料(1.0cm×1.5cm)輕輕的放置于每個培養(yǎng)瓶中央部位的細胞層上,留一組未加材料的做空白對照組。(4)在上述條件下繼續(xù)培養(yǎng),并觀察細胞狀況。(5)1d后取出材料將細胞消化離心后制成細胞懸液。(6)將細胞懸液裝入17mm×100mm的管中,300r/min離心5min。(7)吸去上清液,加入1mL緩沖液重懸細胞,300r/min離心5min。(8)再重復步驟(7)。(9)吸去上清,加入1mL緩沖液重懸細胞,調(diào)整細胞濃度到1.0×109L-1。(10)用PI染色?！稷先?00μL細胞懸液到流式管中,加入試劑A250μL,室溫反應10min?！稷屑尤朐噭〣200μL,室溫反應10min?！稷衙抗芗尤朐噭〤200μL,4℃避光放置10min后進行流式周期分析。設計、實施、評估者:設計為第一、二、三作者,實施為全部作者,通過第二、三作者審核、確認和評估。參與本實驗的作者均經(jīng)過正規(guī)培訓。2結果2.1加樣密度對細胞形態(tài)的影響96孔板在倒置相差顯微鏡下放大100倍觀察,細胞接種24h;各孔細胞密度均勻,貼壁伸展,形態(tài)正常,胞體多觸角。加樣24h后,可見各實驗組與陰性對照組無明顯差異,細胞形態(tài)良好,長滿2/3孔底,并可見分裂細胞,表明細胞生長旺盛,細胞折光性強;陽性對照組細胞多變圓,核固縮或溶解,可見少數(shù)細胞崩解產(chǎn)物和死亡細胞團聚物。各培養(yǎng)瓶的細胞在鏡下可見其形態(tài)良好,加材料后各實驗組細胞形態(tài)見圖1,有分裂現(xiàn)象,表明細胞在增殖生長。2.2陳靈活拉克氏體的生長曲線原材料及其降解物分別與細胞接觸2d和4d后其毒性均為1級,4d時的細胞相對增殖率相對2d時稍低,原因可能為:根據(jù)陳艷梅對成骨細胞生長曲線的研究,4d時細胞處于對數(shù)生長期,空白對照組中的細胞增長較快,而材料組中的細胞受材料壓迫的影響,增長比空白對照組慢些,所以4d時細胞相對增殖率值比2d時有所降低。細胞形態(tài)良好,細胞數(shù)量和活性與陰性對照組相比無明顯差異,符合正常標準,材料對細胞增長沒有抑制作用,屬于合格無毒性。2.3材料的致癌性由圖2和表2可見,和空白對照組相比,各材料組G0/G1期比例有所下降,S期和G2/M期比例有所增加,但大部分都是處于G0/G1期,表明細胞與材料作用后仍是正常的二倍體,未出現(xiàn)異倍體,證明材料無致瘤致癌性。而S期和G2/M期比例增加表明材料能增加成骨細胞DNA的合成,促進成骨細胞分裂增殖,有利于成骨細胞生長和組織修復。3mtt法的生物學特性可降解nHAP/BC復合支架材料具有良好的生物力學性能和生物相容性,但隨著BC的酶解,復合狀態(tài)存在的nHAP在使用過程中離解出來,并具有相對穩(wěn)定的晶體結構。從基體材料上脫落的納米顆粒不僅可以在植入位置附近產(chǎn)生作用,導致炎癥反應;而且可以通過血液或體液循環(huán)分布到肝、腎、脾、骨髓等器官中。因此,有必要對納米纖維支架材料降解后的產(chǎn)物進行安全性評價研究。體外細胞毒性試驗是醫(yī)療器械生物學安全性評價標準ISO10993中的規(guī)定項目,是生物材料進入臨床前的必要評價,但是隨著生物材料發(fā)展的越來越復雜性,毒性試驗方法和準則需要進行不斷的改進。本實驗采用細胞毒性實驗中較嚴格的評價方法——直接接觸法,采取MTT比色法對細胞毒性進行評價,1983年Mosmann首先報道了這種新的快速評定細胞增殖和細胞毒性的比色法,目前該試驗方法在國際上已廣泛地應用于免疫學,腫瘤學和醫(yī)用生物材料的生物相容性評價。MTT法是細胞毒性檢測中的一種常用方法,能夠較快捷準確的反映出材料的細胞毒性。MTT是一種淡黃色的唑氮鹽,能接受氫離子的染料,可以作用于活細胞線粒體中的呼吸鏈,被線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶還原生成藍色的甲瓚結晶,而在毒性環(huán)境中,細胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶活性降低(死細胞中琥珀酸脫氫酶消失)。MTT法的優(yōu)越性就在于其生物學終點為重要的細胞器——線粒體。線粒體在細胞的生命活動中是一個能量供應站,其數(shù)目在細胞活動旺盛時增多,衰退時減少。線粒體病變是細胞受損傷最靈敏的指標,結晶形成的數(shù)目多寡與活細胞數(shù)目和功能狀態(tài)成正相關。同時,本試驗中采用成骨細胞用于細胞毒性試驗,也使檢測材料的毒性更加敏感。材料浸提液或材料與其特定植入部位的靶細胞(成骨細胞)相互作用,不僅能反映材料的細胞毒性,還能反映出材料對細胞毒性增殖、分化等功能的影響。因此,結果可以比較靈敏地反映細胞的毒性損害程度。結果表明nHAP/BC原材料及其降解產(chǎn)物對成骨細胞的形態(tài)無明顯影響,對細胞增殖無明顯抑制作用,該材料無細胞毒性,具有良好的細胞親和性流式細胞儀從原理上來說是一種在計算機技術支持下的高度自動化的細胞顯微脈沖分光光度儀,它能在保持細胞、細胞器或其他微粒結構完整性的狀態(tài)下從分子水平上進行高靈敏度、高信息量、高速度和高精度地定量分析和分選。近年來流式細胞儀已廣泛應用于腫瘤學、生物化學、免疫學等領域,但在材料生物相容性研究領域的應用尚屬少見。生物材料對細胞新陳代謝過程中的細胞毒性作用必然會影響細胞內(nèi)DNA合成等分子水平的改變。Chou對此提出材料的分子相容性概念。采用流式細胞儀評價材料的生物相容性,比較客觀、精確、快速、可靠,是一種很好的評價方法。本文在傳統(tǒng)的細胞毒性MTT比色法的基礎上進一步使用流式細胞儀嘗試分析材料作用于細胞后對其增殖周期各時相的影響,從而在分子水平上評價材料對細胞的毒性作用。流式細胞儀對細胞周期的分析主要是對單個細胞內(nèi)DNA含量的分析,通過標記物發(fā)出紅色熒光的強弱可推算出G0、G1期(二倍體)、S期(超二倍體)、G2、M期(四倍體)的比例,其結果以DNA分布的直方圖形式顯示,進而可計算出G0/G1期,S期,G2/M期的比例來了解細胞的增殖能力,并可了解細胞的增殖狀態(tài)。本實驗采用PI對細胞進行染色,再用流式細胞儀對成骨細胞的DNA進行分析,從分子水平上進一步表明原材料及其降解物無致瘤致癌性,并且能增加成骨細胞DNA的合成,促進成骨細胞分裂增殖,有利于成骨細胞的生