基于超高分辨率顯微鏡成像技術(shù)的納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)

基于超高分辨率顯微鏡成像技術(shù)的納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)

氮（n）、碳（c）、硫（s）等生命因素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程主要由微生物驅(qū)動(dòng)。耦合分析自然環(huán)境中微生物遺傳多樣性與其代謝多樣性是當(dāng)今微生物生態(tài)學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。自然環(huán)境中的微生物多樣性極為豐富,每噸土壤中的微生物類群可高達(dá)400萬種,海洋中的微生物類群也超過200萬種。實(shí)驗(yàn)室富集分離的傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法對微生物生理生態(tài)功能的認(rèn)識(shí)做出了巨大貢獻(xiàn),但截止到2003年7月,全球范圍內(nèi)僅分離培養(yǎng)出4800種細(xì)菌,這極大地限制了人們對微生物功能多樣性的認(rèn)識(shí)。過去幾十年里,人們通過從環(huán)境樣品中提取微生物DNA直接進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),并利用PCR產(chǎn)物構(gòu)建克隆文庫并進(jìn)行測序分析,發(fā)現(xiàn)了大量的未知序列。通過將這些未知序列與已知的分離培養(yǎng)微生物序列進(jìn)行比對,從而推測這些未培養(yǎng)微生物的可能代謝類型,成為人們認(rèn)識(shí)微生物多樣性和功能的重要手段。但是,具有相似16SrRNA基因組成的類群不一定具有相同的代謝功能,豐度較高的微生物并不一定發(fā)揮更重要的生態(tài)功能,而且PCR反應(yīng)可能帶來一定的偏差,這成為基于PCR的分子生物學(xué)研究手段的主要缺陷?？紤]到微生物的廣泛分布及其在元素地球化學(xué)循環(huán)中的重要作用,需要更先進(jìn)的技術(shù)對自然環(huán)境樣品中的微生物群落和功能進(jìn)行探測。近年逐步興起的納米二次離子質(zhì)譜技術(shù)(NanoSIMS)在國際上已被廣泛應(yīng)用于地球科學(xué)、材料科學(xué)、比較行星學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和礦物學(xué)等領(lǐng)域,并在微生物生態(tài)學(xué)研究中顯示出巨大的潛力,是當(dāng)前最為先進(jìn)的表面和界面分析技術(shù),具有廣闊的應(yīng)用前景。通過利用穩(wěn)定性或放射性同位素在原位或者微宇宙條件下標(biāo)記目標(biāo)微生物,并與特異性的熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、催化報(bào)告沉積熒光原位雜交技術(shù)(CARD-FISH)、鹵素原位雜交技術(shù)(HISH)等聯(lián)合應(yīng)用,NanoSIMS為從單細(xì)胞成像水平上研究復(fù)雜環(huán)境樣品中微生物群落的組成和代謝特征提供了前所未有的可能性,其極高的靈敏度和準(zhǔn)確性比其它的單細(xì)胞研究手段更具優(yōu)勢。本文將對納米二次離子質(zhì)譜的工作原理及其在微生物生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用、存在的問題和發(fā)展趨勢等進(jìn)行簡要介紹。1次離子質(zhì)譜成像技術(shù)二次離子質(zhì)譜技術(shù)(SIMS)是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種表面分析技術(shù),它以一種離子(如Cs+或O-初級離子束)轟擊固體表面,再將從表面濺射出來的次級離子引入磁場質(zhì)量分析器,不同離子根據(jù)質(zhì)荷比不同在靜電場區(qū)被分離開,經(jīng)質(zhì)譜檢測器檢測記錄并成像,得出被分析樣品表面的元素或化合物的組分。SIMS可以檢測從氫到鈾的所有元素、同位素和化合物,并以檢測原離子轟擊樣品表面產(chǎn)生的特征(“指紋”)次級離子譜為基礎(chǔ)的,因此既可提供樣品表面元素的信息,也可提供化學(xué)組分的信息,具有較高的空間分辨率和質(zhì)量分辨率。SIMS技術(shù)經(jīng)歷了幾次更新,被廣泛應(yīng)用于材料學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、地質(zhì)學(xué)和土壤學(xué)等領(lǐng)域。SIMS一般分為靜態(tài)SIMS和動(dòng)態(tài)SIMS兩種。靜態(tài)SIMS,例如飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜(ToF-SIMS),根據(jù)測定激發(fā)的二次離子飛行到接收器所用的時(shí)間來判斷離子種類,一般對樣品表面的一個(gè)到兩個(gè)原子層(<1nm)進(jìn)行分析,只能提供關(guān)于樣品淺層表面的信息,在應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究時(shí)很難找到合適的條件同時(shí)滿足較高質(zhì)量分辨率和空間分辨率(一般只能達(dá)到微米級)的要求;而動(dòng)態(tài)SIMS如CAMECAIMS1270-180型、CAMECAIMS-3f-7f型、及最先進(jìn)的CAMECANanoSIMS50L型,主要根據(jù)二次離子在磁場中的偏轉(zhuǎn)半徑不同來確定離子種類,可以獲得樣品表面幾微米內(nèi)元素同位素分布和組成的信息(空間分辨率達(dá)到亞微米級或者納米級),成像水平比靜態(tài)SIMS明顯提高,在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用也日漸成熟。法國CAMECA公司生產(chǎn)的NanoSIMS50L型是當(dāng)前最為先進(jìn)的動(dòng)態(tài)二次離子質(zhì)譜,相比于傳統(tǒng)的離子探針具有極高的靈敏度和空間分辨率,其中銫(Cs+)離子源的分辨率達(dá)到50nm,氧(O-)離子源的分辨率達(dá)到150nm,并且具有極高的質(zhì)量分辨率,如能夠有效區(qū)分13C-與12C1H-、12C15N-與13C14N-之間的細(xì)微質(zhì)量差異,并且能夠同時(shí)對7種離子進(jìn)行成像分析和精確定量。CAMECANanoSIMS50L與傳統(tǒng)的二次離子質(zhì)譜儀的工作原理非常相似,都是通過用一次離子束轟擊的方式激發(fā)樣品表面產(chǎn)生二次離子,進(jìn)而分析樣品表面元素同位素組成和豐度。具體工作流程為:首先將離子源(Cs+或者O-)產(chǎn)生的一次離子在真空加速器中加速形成具有幾千電子伏特(KeV)的離子束,當(dāng)這些高能量的離子束聚焦并轟擊固體薄片樣品表面(微生物細(xì)胞)時(shí),濺射出樣品中的二次離子,這些具有不同荷質(zhì)比的二次離子由于在磁場中偏轉(zhuǎn)半徑不同而到達(dá)多接收器的不同位置,然后通過接收器上的法拉第環(huán)或者電子倍增器測量不同離子的強(qiáng)度,進(jìn)而成像并通過圖像定量分析軟件計(jì)算出樣品表面的元素同位素的豐度和組成信息(圖1)。測定的同位素比值信息(例如13C-/12C-)不僅可以用于計(jì)算單細(xì)胞的元素吸收速率,還可以表征元素的代謝途徑。選擇合適的離子源對于正確分析樣品信息極為關(guān)鍵,銫(Cs+)離子源激發(fā)的負(fù)二次離子可以用來分析C、CN、P、S、O、H和鹵族元素等,一般在微生物生態(tài)學(xué)研究中被廣泛采用,而氧(O-)離子源激發(fā)的正二次離子適合于進(jìn)行金屬的表面分析。2nanosims分析二次離子質(zhì)譜技術(shù)(SIMS)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用始于2001年。Orphan等首次利用FISH與SIMS結(jié)合的方法證實(shí)了海洋沉積物中存在厭氧甲烷氧化古菌,能夠代謝13C—CH4。但當(dāng)時(shí)對同位素組成分析和FISH顯影分析需在不同的儀器上完成,而且SIMS的橫向分辨率較低,不能有效地對微生物的細(xì)胞進(jìn)行辨識(shí),最新的CAMECANanoSIMS50L型二次離子質(zhì)譜儀有效克服了這一難題。應(yīng)用NanoSIMS進(jìn)行單細(xì)胞成像分析的主要步驟為:在實(shí)驗(yàn)室微宇宙培養(yǎng)或原位條件下,將采集的環(huán)境樣品或可培養(yǎng)的微生物暴露在富含穩(wěn)定性同位素(15N或13C等)或者放射性同位素基質(zhì)的環(huán)境中,經(jīng)過短期的同位素標(biāo)記過程之后,將樣品進(jìn)行固定、脫水,形狀不規(guī)則樣品需要用環(huán)氧樹脂包埋,絕緣的樣品(絕大多數(shù)微生物生態(tài)學(xué)研究樣品)需要進(jìn)行導(dǎo)電鍍膜(Au,Pt,Au/Pd或者C)處理,制備成表面平整、符合儀器真空條件的薄片樣品進(jìn)行NanoSIMS分析。為了鑒別環(huán)境樣品中的目標(biāo)微生物,NanoSIMS需要與透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)、熒光原位雜交(FISH)、催化報(bào)告沉積熒光原位雜交(CARD-FISH)、鹵素原位雜交(HISH)、X射線能譜儀(EDSX-ray)等聯(lián)合使用來識(shí)別微生物的種類和功能(圖2)。3納米二次離子質(zhì)量分析技術(shù)納米sims的應(yīng)用3.1nanosims與tem的聯(lián)合應(yīng)用氮的生物地球化學(xué)循環(huán)主要由一系列微生物所驅(qū)動(dòng),識(shí)別并確定參與不同氮轉(zhuǎn)化途徑(包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用)的功能微生物是當(dāng)前氮循環(huán)機(jī)制研究的核心問題之一。NanoSIMS技術(shù)在氮循環(huán)過程方面的應(yīng)用首先在固氮微生物的研究上取得進(jìn)展(表1)。2006年,Lechene等首次利用NanoSIMS從單細(xì)胞水平上研究并確定了實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的固氮菌株Teredinibacterturnerae的固氮特性。2007年,Lechene等又對與一種名為Lyroduspedicellatus的船蛆(Shipworm)體內(nèi)共生的固氮細(xì)菌進(jìn)行了定量研究。由于船蛆本身的食物鏈中不包含氮元素,所以必須依靠與其共生的微生物提供氮源。Lechene等在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下向含有船蛆Lyroduspedicellatus的海水中注入穩(wěn)定性同位素底物15N2,然后經(jīng)過8d的暴露培養(yǎng)之后,先對樣品進(jìn)行透射電子顯微鏡(TEM)掃描確定待研究的船蛆組織中共生固氮細(xì)菌的位置,通過NanoSIMS分析后發(fā)現(xiàn)固氮細(xì)菌及周圍組織均被15N所標(biāo)記上,這直觀有力地提供了船蛆依賴固氮微生物獲取氮源的證據(jù)。這些早期利用NanoSIMS技術(shù)研究固氮微生物細(xì)胞功能的例子顯示出單細(xì)胞成像技術(shù)的巨大應(yīng)用潛力。固氮微生物中另一類被廣泛研究的是絲狀藍(lán)藻,它們能夠同時(shí)固定N2和CO2,其較大的細(xì)胞個(gè)體與獨(dú)特的形態(tài)特征為NanoSIMS的應(yīng)用提供了便利。絲狀藍(lán)藻包括營養(yǎng)細(xì)胞和異型胞,但是過去由于研究手段的限制,對氮元素和碳元素在這些細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)運(yùn)和流動(dòng)并不清楚。Popa等通過結(jié)合高分辨率的NanoSIMS與穩(wěn)定性同位素標(biāo)記技術(shù)對絲狀固氮藍(lán)藻A.oscillarioides的研究發(fā)現(xiàn),新固定的氮元素可以被異型胞快速轉(zhuǎn)運(yùn),并最終分配到營養(yǎng)細(xì)胞中去。此外,NanoSIMS還可以根據(jù)細(xì)胞組織不同的元素組成從亞細(xì)胞水平上進(jìn)一步觀察絲狀藍(lán)藻A.oscillarioides體內(nèi)的元素分布狀況。另一個(gè)類似的通過NanoSIMS和TEM對固氮藍(lán)藻菌株Trichodesmium的研究發(fā)現(xiàn)了更為細(xì)致的13C和15N吸收的時(shí)空分布特征,其中CO2的固定速率在上午達(dá)到最高水平,而N2的固定速率則在下午達(dá)到最高水平,并且新固定的C和N主要貯存在藻青素顆粒中。這些研究說明,將同位素標(biāo)記技術(shù)與NanoSIMS和TEM成像技術(shù)聯(lián)合使用,能夠在探究微生物細(xì)胞的生理組成元素及其相關(guān)代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)過程方面發(fā)揮巨大作用。在最近的研究中它們用于分析兩種不同的絲狀藍(lán)藻Nodulariaspumigena和Aphanizomenonsp.對于波羅的海(BalticSea)碳氮循環(huán)的重要性,同時(shí)結(jié)合微傳感器技術(shù)測定了兩種不同藍(lán)藻類群單細(xì)胞水平的氮固定和碳固定速率,從而能夠更加準(zhǔn)確地估測不同碳氮微生物對全球碳氮循環(huán)的貢獻(xiàn)率。除了對實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的固氮藍(lán)藻進(jìn)行分析之外,NanoSIMS同樣也能夠用于分析環(huán)境樣品中的固氮微生物。最近,Foster等利用15N2同位素標(biāo)記與NanoSIMS結(jié)合的方法首次對寡營養(yǎng)海水中的3種硅藻-藍(lán)藻共生體的單細(xì)胞固氮速率進(jìn)行了測定,解決了過去由于技術(shù)手段限制不能夠?qū)⒐柙?藍(lán)藻共生體與其它固氮菌分離研究的難題。Halm等通過FISH與NanoSIMS聯(lián)合使用,識(shí)別出在湖水厭氧層中發(fā)揮固氮作用的微生物主要是數(shù)量非常少的綠硫細(xì)菌Chlorobiumsp.。在更為復(fù)雜的河流沉積物樣品中,Dekas等運(yùn)用這2項(xiàng)技術(shù)對具有甲烷厭氧氧化功能的古菌ANME-2和細(xì)菌DSS類群的聚合體進(jìn)行了研究,在經(jīng)過6個(gè)月的15N2同位素培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之后,根據(jù)15N的吸收分布情況,發(fā)現(xiàn)這種聚合體中的ANME-2古菌具有固定氮?dú)獾墓δ?并且能夠?qū)⒐潭ǖ牡剞D(zhuǎn)運(yùn)給DSS細(xì)菌。近年來,隨著第一株具有氨氧化功能的古菌在實(shí)驗(yàn)室獲得純培養(yǎng),氨氧化古菌(AOA)作為除細(xì)菌以外硝化作用的主要參與者,成為當(dāng)前微生物生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。奧地利維也納大學(xué)的Tourna等成功地從土壤中富集到了氨氧化古菌Nitrososphaeraviennensis,該菌株只有在添加有低濃度丙酮酸的培養(yǎng)基中才能將NH+4轉(zhuǎn)化成NO-2。為了驗(yàn)證該菌是否利用丙酮酸中的C元素來合成細(xì)胞組織,他們在含有N.viennensis的培養(yǎng)基中加入13C標(biāo)記的丙酮酸,在37ue84aSymbolpB@C培養(yǎng)10d后運(yùn)用NanoSIMS對樣品進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)大約有10%的C元素來自于13C-丙酮酸,其余的主要來自于對碳酸氫鹽的固定,證明N.viennensis具有化能自養(yǎng)和混合營養(yǎng)生長的潛能。該項(xiàng)研究是首次將NanoSIMS技術(shù)用于氨氧化微生物,對于探索新發(fā)現(xiàn)的氨氧化古菌的生理代謝機(jī)制提供了新的思路。3.2nanosims技術(shù)近些年發(fā)展起來的鹵素原位雜交(HISH)與NanoSIMS聯(lián)用的技術(shù)能夠分析環(huán)境樣品中的微生物組成,并同時(shí)定量測定單細(xì)胞的代謝功能。Musat等首先將這種聯(lián)用技術(shù)用于研究寡營養(yǎng)湖水中3種厭氧光合細(xì)菌Chromatiumokenii,Lamprocystispurpurea和Chlorobiumclathratiforme對H13CO-3和15NH+4的吸收特征。他們通過實(shí)驗(yàn)室短期的微宇宙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),同種光合細(xì)菌的不同細(xì)胞表現(xiàn)出極大的代謝速率差異,不同類群光合細(xì)胞之間的差異更大。其中,僅占細(xì)胞總數(shù)0.03%的C.okenii貢獻(xiàn)了光合細(xì)菌碳吸收總量的70%和氮吸收總量的40%,這表明湖水中厭氧光合細(xì)菌的碳氮吸收過程主要是由一部分?jǐn)?shù)量非常稀少的類群所完成的。NanoSIMS技術(shù)在碳循環(huán)微生物方面的另一類應(yīng)用主要是對于甲基營養(yǎng)菌(包括甲醇營養(yǎng)菌和甲烷營養(yǎng)菌)的研究。Li等利用碘標(biāo)記的寡核苷酸探針原位雜交與NanoSIMS結(jié)合的方法對生物反應(yīng)器中甲醇營養(yǎng)菌的組成和功能進(jìn)行了分析。為了研究生物反應(yīng)器系統(tǒng)中微生物吸收甲醇的機(jī)理,他們采用13C-甲醇培養(yǎng)采自生物反應(yīng)器的樣品,厭氧培養(yǎng)25d后,首先用以碘標(biāo)記的針對細(xì)菌和古菌的特異性探針確定樣品里的微生物類群,然后將樣品固定用于NanoSIMS分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)古菌是生物反應(yīng)器中吸收甲醇的主要功能微生物。此外,Behrens等運(yùn)用類似的方法發(fā)現(xiàn)了口腔生物膜上的Cytophaga-Flavobacterium類群吸收13C-氨基酸的功能。3.3其他微生物群硫酸鹽還原菌(SRB)是硫元素生物地球化學(xué)循環(huán)過程的關(guān)鍵功能類群,經(jīng)典的分子生物學(xué)研究手段已經(jīng)對SRB的種群組成和豐度進(jìn)行了深入研究,但尚不能在單細(xì)胞水平解析其生理代謝功能特征。近期,美國研究者Fike等利用最新的NanoSIMS50L型二次離子質(zhì)譜儀,并結(jié)合CARD-FISH技術(shù),成功地為解決這一問題提供了新的視角,識(shí)別出在高鹽環(huán)境下微生物墊中參與硫循環(huán)的主要微生物類群是Desulfobacteraceae科的硫酸鹽還原菌。他們首先用外層包裹有35SO4的銀箔與微生物墊中可溶性的硫化物反應(yīng),由于硫化物與35SO4的氧化還原反應(yīng)使硫化物中的34S固定在銀箔表面,然后通過NanoSIMS成像技術(shù)就能夠測定樣品中δ34S同位素的組成情況,從而計(jì)算出不同微生物墊深度上硫化物的濃度。NanoSIMS所生成的二維圖像表明,微生物墊中硫化物的濃度隨著深度的增加而減少,這種變化趨勢與利用CARD-FISH所測定的Desulfobacteraceae科的硫酸鹽還原菌豐度隨微生物墊深度的變化趨勢相吻合,說明Desulfobacteraceae科對微生物墊中硫化物的空間分布具有決定作用。以往對于硫酸鹽還原菌的研究多停留在對其總的豐度和結(jié)構(gòu)組成分布上,而通過使用NanoSIMS與CARD-FISH結(jié)合的方法能夠?qū)⑽⑸锏目臻g分布與硫化物的空間分布聯(lián)系在一起,更容易識(shí)別硫酸鹽還原過程中的關(guān)鍵活躍類群。3.4nanosims的原位研究NanoSIMS技術(shù)除了在氮、碳、硫等元素的生物地球化學(xué)循環(huán)研究中得到廣泛應(yīng)用外,研究者們也在不斷拓展著NanoSIMS在微生物生態(tài)學(xué)方面的應(yīng)用范圍。微生物的空間分布及其在土壤基質(zhì)中的功能活性對于元素地球化學(xué)循環(huán)具有極為重要的影響,而且土壤的高度異質(zhì)性為微生物提供了無數(shù)性質(zhì)各異的微環(huán)境,將土壤理化環(huán)境的異質(zhì)性與其對生物過程的影響聯(lián)系起來是當(dāng)今土壤微生物生態(tài)學(xué)的研究前沿之一,然而過去的技術(shù)手段對于分析微生物與土壤基質(zhì)接觸的生物物理界面無能為力。2007年,Herrmann等創(chuàng)新地將NanoSIMS運(yùn)用于土壤微生物的活性與空間分布的研究,并同時(shí)觀察了土壤物理微環(huán)境對于微生物的影響。他們首先將土壤中廣泛分布的Pseudomonasfluorescens的純培養(yǎng)菌株(NCTC10038)在含有15NH+4的培養(yǎng)基中進(jìn)行標(biāo)記24h后,混入土壤樣品中,然后用環(huán)氧樹脂固定并切片供NanoSIMS觀察。其中,28Si-離子成像圖用來表示土壤基質(zhì)的組成,12C-成像圖表示樹脂的組成,12C14N-成像圖表示含氮有機(jī)質(zhì),12C15N-與12C14N-的比值(即15N/14N)可以表示15N-P.fluorescens的分布(圖3)。從NanoSIMS成像圖中,可以清晰地看到15N標(biāo)記的P.fluorescens主要分布在土壤粒子的邊緣部分。該項(xiàng)研究顯示出NanoSIMS在分析微生物在土壤中的微域分布及其與土壤基質(zhì)相互作用方面的巨大可能性。類似的研究方法已經(jīng)開始用于對土壤-微生物-植物相互作用的研究。Clode等利用NanoSIMS在原位狀態(tài)下研究了15N元素在土壤根際圈的轉(zhuǎn)運(yùn)情況,并重點(diǎn)關(guān)注了植物細(xì)胞與根際微生物對N元素的相互競爭。這種原位研究元素流動(dòng)的高分辨率成像方法顯示了NanoSIMS在分析復(fù)雜土壤環(huán)境中微生物過程的優(yōu)越性,而以往的此類研究只能主要依靠簡單的數(shù)學(xué)模型分析。NanoSIMS在微生物生態(tài)學(xué)方面的其它可能應(yīng)用還包括:控制土壤礦物質(zhì)表面磷肥固定的微生物機(jī)理,促進(jìn)有機(jī)質(zhì)在土壤中穩(wěn)定化過程的微生物類群,土壤基質(zhì)中微生物與特定礦物質(zhì)的相互作用,土壤中目標(biāo)微生物活躍類群的空間分布,影響微生物水平基因轉(zhuǎn)移的微觀尺度因素等。4應(yīng)該注意的是，使用納米技術(shù)4.1溫度脫水與化學(xué)固定的組合樣品制備是NanoSIMS分析中極為關(guān)鍵的環(huán)節(jié),因?yàn)镹anoSIMS一般在超高真空環(huán)境中進(jìn)行操作,因此制備的環(huán)境樣品必須充分脫水并且能夠承受真空。樣品脫水的方法一般包括化學(xué)固定液(如加入乙醇、甲醛或戊二醛等)、低溫脫水、環(huán)氧樹脂包埋等。不同的脫水方法適用于不同樣品的NanoSIMS分析,如果在樣品制備的過程中待分析的元素有可能發(fā)生轉(zhuǎn)移和流動(dòng),最好使用低溫脫水方法來固定樣品的形態(tài),例如在研究固氮微生物的碳氮吸收途徑的時(shí)候。對于形狀不規(guī)則的樣品最好用樹脂進(jìn)行包埋,然后切成薄片狀以便進(jìn)行NanoSIMS分析。甲醛固定液對于微生物細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸有非常有效的固定和脫水作用,但是在固定的過程中也有可能引入微生物細(xì)胞中的12C,從而使NanoSIMS的分析出現(xiàn)一定的偏差。尤其是當(dāng)NanoSIMS與熒光雜交技術(shù)如FISH、CARD-FISH和HISH聯(lián)用時(shí),最好使用多聚甲醛對樣品進(jìn)行脫水處理。Peteranderl和Lechene比較了低溫脫水與化學(xué)固定對樣品制備的不同影響,發(fā)現(xiàn)化學(xué)固定導(dǎo)致二次離子12C-和12C14N-的產(chǎn)率降低,并且化學(xué)固定液有可能洗脫低分子量的細(xì)胞組織。而Ploug等對這2種脫水方法的研究表明,化學(xué)固定法并沒有顯著地影響待測樣品的元素組成。4.2nanosims分析之前的特征在NanoSIMS分析中,不同的二次離子能夠表征樣品的不同組成,因此如何正確地將離子成像信息與微生物類群聯(lián)系起來顯得非常關(guān)鍵。例如在固氮硅藻-藍(lán)藻共生體的研究中就會(huì)遇到類似的難題,因?yàn)楣采{(lán)藻細(xì)胞經(jīng)常生長在硅藻的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間,為有效區(qū)分這兩種不同微生物對N的吸收帶來較大困難,因此在NanoSIMS分析之前必須首先破壞去除硅藻的細(xì)胞壁,然后再進(jìn)行下一步分析。識(shí)別復(fù)雜環(huán)境樣品中的微生物類群也可以通過在NanoSIMS分析之前首先進(jìn)行FISH或者CARD-FISH分析,以此確定微生物的組成和種類,但是將熒光原位雜交的圖像與NanoSIMS分析的圖像正確地聯(lián)系在一起也是非常艱