基因工程制藥的下游技術(shù)

基因工程藥物的分離純化技術(shù)

基因工程藥物的特點(diǎn)目的產(chǎn)物在初始物料中含量低含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差種類繁多（多糖、多肽、蛋白質(zhì)、抗體、疫苗等）應(yīng)用面廣，對其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱源等下游技術(shù)指從發(fā)酵液中分離和純化產(chǎn)品的技術(shù)過程，包括固液分離技術(shù)（離心、過濾、沉淀等）、細(xì)胞破壁技術(shù)（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶等）、蛋白質(zhì)純化技術(shù)（沉淀法、色譜分離法和超濾法等），最后還有產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)（真空干燥、冰凍干燥等），是運(yùn)用生物化學(xué)、物理學(xué)方法分離、純化產(chǎn)品，最終將產(chǎn)品推向市場并獲得社會或經(jīng)濟(jì)效益的過程?；蚬こ坍a(chǎn)業(yè)化除上游構(gòu)建工程菌之外,下游必須建立生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵工藝、離心、細(xì)胞破碎、目的產(chǎn)物的分離、純化、恢復(fù)表達(dá)產(chǎn)物的天然結(jié)構(gòu)使之具有生物活性、表達(dá)產(chǎn)物的修飾加工等。就基因工程產(chǎn)業(yè)化而言,下游技術(shù)的研究與建立是十分重要的,又是十分耗時(shí)的,需要遠(yuǎn)比上游研究多得多的投資。（一）、建立工藝需了解各種因素含目的產(chǎn)物的初始物料的特點(diǎn)物料中雜質(zhì)種類和性質(zhì)目的產(chǎn)物特性產(chǎn)品質(zhì)量要求與傳統(tǒng)方式相似,重組蛋白的分離純化也是利用其物理和化學(xué)性質(zhì)的差異,在進(jìn)行任何一種蛋白質(zhì)純化工藝設(shè)計(jì)之前,都需要盡可能多地先對提純的體系,目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行了解。如目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、疏水性、帶電性、碳?xì)滏溁蜃杂蓭€基存在情況等。另外還需對影響目標(biāo)蛋白活性的因素有了解,如溫度、ｐH、有機(jī)溶劑、蛋白變性劑、重金屬離子、機(jī)械剪切力等,以保證純化后的蛋白活性。當(dāng)前蛋白質(zhì)的純化主要是依靠色譜（層析技術(shù)）和電泳技術(shù)。由于重組蛋白在組織和細(xì)胞中仍以復(fù)雜混合物的形式存在,因此到目前為止還沒有一個(gè)單獨(dú)或一整套現(xiàn)成的方法把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中分離出來,而只能依據(jù)目標(biāo)蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)摸索和選擇一套綜合上述方法的適當(dāng)分離程序,以獲得較高純度的制品。（二）、分離純化的基本過程細(xì)胞破碎固液分離濃縮與初步純化高度純化直至得到純品成品加工（三）、細(xì)胞的破碎方法物理破碎法：高壓勻漿法、高速珠磨法、超聲破碎法、高壓擠壓法化學(xué)破碎法：滲透沖擊、增溶法、脂溶法生物破碎法：酶溶法（四）、固液分離沉淀：鹽沉淀、有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀、熱變性沉淀離心：高速離心和超速離心膜過濾：微濾、超濾和反滲透雙水相萃取

（五）、重組蛋白質(zhì)的分離純化分離純化主要依賴色譜層析分離方法。分為離子交換色譜、疏水色譜、反相色譜、親和色譜、凝膠過濾色譜及高壓液相色譜等色譜技術(shù)是醫(yī)藥生物技術(shù)下游過程精制階段的常用手段，其優(yōu)點(diǎn)是該法具有多種多樣的分離機(jī)制、設(shè)備簡單、便于自動(dòng)化控制和分離過程中無發(fā)熱等有害效應(yīng)2011-10-3011基因工程下游技術(shù)離子交換層析離子交換層析(ionexchangechromatography，IEC）是以蛋白質(zhì)分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎(chǔ)的。具體就是利用蛋白質(zhì)帶電性的差異,在離子吸附劑上靜電吸附能力不同,用不同的pH/離子強(qiáng)度洗脫液洗脫,從而使蛋白質(zhì)分離的柱層析方法。離子交換色譜分辨率高、容量大、操作容易，為多肽、蛋白質(zhì)、核酸和許多發(fā)酵產(chǎn)物分離純化的一種重要方法離子交換又分為：陽離子交換劑和陰離子疏水層析疏水層析(hydrophobicinteractionchromatography，HIC）是利用蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域與固定相上疏水性基團(tuán)相互作用力的差異，對蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離的層析方法廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)類大分子的分離以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和折疊機(jī)制的研究等在高鹽濃度時(shí)，蛋白質(zhì)與固定相疏水締合；鹽濃度降低時(shí)蛋白質(zhì)疏水作用減弱，目的蛋白質(zhì)被逐步洗脫下來疏水色譜回收率較高，蛋白質(zhì)與固定相的疏水作用力較弱，蛋白質(zhì)變性的可能性小，蛋白質(zhì)活性在層析分離過程中不易喪失親和層析親和層析(affinitychromatography，AC）是利用固定化配體與目的蛋白質(zhì)之間非常特異的生物親和力進(jìn)行吸附，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除親和色譜是分離純化蛋白質(zhì)、酶等生物大分子最為特異而有效的層析技術(shù)，分離過程簡單、快速，具有很高的分辨率，在生物分離中有廣泛的應(yīng)用。同時(shí)也可用于某些生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的研究凝膠過濾層析凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography）又稱為凝膠排阻層析、分子篩層析，是以多孔性凝膠填料為固定相，按分子大小對溶液中各組分進(jìn)行分離的液相層析方法。填料有一定大小范圍的孔徑，大分子進(jìn)不去先洗脫，小分子進(jìn)入孔徑而后被阻滯，不同的蛋白質(zhì)根據(jù)它們大小和形狀的不同在層析柱中被分離優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡單、操作方便、樣品回收率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、不改變樣品生物學(xué)活性等缺點(diǎn)：分辨率較低，尤其是相對分子質(zhì)量相近的分子之間廣泛用于蛋白質(zhì)(酶）、核酸、多糖等生物大分子的分離純化用于蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的測定、脫鹽、樣品濃縮等（六）、非蛋白質(zhì)類雜質(zhì)的去除DNA的去除：離子交換層析、親和層析、疏水層析熱原質(zhì)的去除：最好的方法是防止產(chǎn)生熱原質(zhì)，陰離子交換層析法，疏水層析法，親和層析法（多黏菌素B）病毒的去除：色譜分離、紫外線照射和過濾根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇根據(jù)分離單元之間的銜接選擇根據(jù)分離純化工藝的要求來選擇（七）、選擇分離純化方法的依據(jù)7.1根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來選擇分泌型表達(dá)產(chǎn)物：濃縮處理（沉淀和超濾）可溶性表達(dá)產(chǎn)物：親和層