動植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

2.3動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1962年，實(shí)現(xiàn)了倉鼠腎細(xì)胞（BHK）的大規(guī)模培養(yǎng)，這一成果標(biāo)志著動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的成熟與商業(yè)應(yīng)用時代的開始。1975年，成功融合了小鼠B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，構(gòu)建了能生產(chǎn)特定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。1986年，首次成功地用微囊化技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞來生產(chǎn)單克隆抗體。動物細(xì)胞的形態(tài)A、貼壁依賴型依賴型細(xì)胞的生長繁殖需要一個固體支撐物。體外培養(yǎng)時，依賴型細(xì)胞通過改變表面形態(tài)形成稱為“假足”的突出物，借以吸附在培養(yǎng)器皿內(nèi)壁或其他固體支撐物上。大多數(shù)動物細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞和原核細(xì)胞均屬此類型。

1、成纖維細(xì)胞（fibroblast或mechanocytetype)2、上皮細(xì)胞（epithiliumcell)3、游走細(xì)胞（wonderingcell）4、多形性細(xì)胞（polymorphiccell)一、動物細(xì)胞的類型B、懸浮型或非貼壁依賴型非依賴型細(xì)胞能以懸浮的、游離的形態(tài)進(jìn)行深層培養(yǎng)。來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞和其他轉(zhuǎn)化細(xì)胞均屬于這一類型細(xì)胞，可采用類似于微生物培養(yǎng)的方式進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)時細(xì)胞呈圓形。二、動物細(xì)胞系的獲取和建立游離動物細(xì)胞的制備雜交細(xì)胞的獲得通過細(xì)胞融合技術(shù)，可將高效表達(dá)目標(biāo)蛋白的異源細(xì)胞的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移至所選擇的可快速增殖的親本細(xì)胞中，獲得雜交細(xì)胞。PEG誘導(dǎo)融合和電場誘導(dǎo)融合是目前常用的細(xì)胞促融手段。雜交細(xì)胞的篩選篩選的機(jī)理是：將細(xì)胞融合后所得的各類型的細(xì)胞混合物接種于選擇性培養(yǎng)基上，終止同型雙核或多核融合子、異型多核融合子及未融合親本細(xì)胞的繁殖。目前最常用的篩選系統(tǒng)（或方法）有：HAT篩選系統(tǒng)、抗藥性篩選系統(tǒng)和營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)。生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求原代細(xì)胞二倍體細(xì)胞系轉(zhuǎn)化細(xì)胞系1、原代細(xì)胞是直接取自動物組織器官經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（109/g）。需要大量動物，費(fèi)錢費(fèi)勞力。雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。2、二倍體細(xì)胞系原代細(xì)胞經(jīng)過傳代篩選克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的特點(diǎn)①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。3、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的、人工的、從動物腫瘤組織中建立。4、融合細(xì)胞系仙臺病毒融合法聚二乙醇融合法電融合法三、動物細(xì)胞培養(yǎng)特性比較項(xiàng)目微生物哺乳動物細(xì)胞植物細(xì)胞大小1－10μm10－100μm10－100μm懸浮生長可以多數(shù)細(xì)胞需貼壁生長可以，但易成團(tuán)，無單個細(xì)胞營養(yǎng)要求簡單非常復(fù)雜較復(fù)雜生長速率快，倍增時間為0.5-5小時慢，倍增時間為15－100小時慢，倍增時間為24－74小時代謝調(diào)節(jié)內(nèi)部內(nèi)部、激素內(nèi)部、激素動植物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)的比較動植物細(xì)胞培養(yǎng)和微生物培養(yǎng)的比較（續(xù)）比較項(xiàng)目微生物哺乳動物細(xì)胞植物細(xì)胞環(huán)境敏感性能忍受廣泛范圍非常敏感，僅忍受很窄范圍能忍受廣泛范圍細(xì)胞分化無有有剪切力敏感低非常高高傳統(tǒng)變異、篩選技術(shù)廣泛使用不常使用有時使用細(xì)胞或產(chǎn)物濃度較高低低四、動物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)及過程控制培養(yǎng)基A、物理性質(zhì)1、pH值：正常成纖維細(xì)胞：pH7.4—7.7；轉(zhuǎn)化細(xì)胞：pH7.0—7.4。酚紅的呈色：

紫色■紅帶藍(lán)■紅色■橙色■黃色■呈色7.87.67.47.06.5pH2、溫度不同來源的動物細(xì)胞，其最適生長溫度不同。人和哺乳動物的最適生長溫度是37℃，而昆蟲細(xì)胞的最適生長溫度為25～28℃。動物細(xì)胞的培養(yǎng)溫度必須嚴(yán)格控制，允許波動范圍在±0.25℃之內(nèi)。3、通氣與攪拌溶解氧是細(xì)胞代謝所必需的。動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中溶氧濃度必須適中，溶氧濃度過高可能對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，但當(dāng)溶氧濃度過低時，又成為細(xì)胞生長的限制因素。培養(yǎng)基B、血清1、常用血清：

小牛血清、胎牛血清、馬血清、人血清添加血清有助于細(xì)胞貼壁和生長。2、血清提供的主要成分：

蛋白質(zhì)、多肽、激素、代謝物和營養(yǎng)物、無機(jī)物天然培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好；缺點(diǎn)：來源有限，成分復(fù)雜，個體差異大。培養(yǎng)基C、合成培養(yǎng)基1、氨基酸2、維生素3、鹽4、葡萄糖5、有機(jī)添加劑6、激素和生長因素合成培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)：來源方便，標(biāo)準(zhǔn)化產(chǎn)品；缺點(diǎn)：不能完全滿足細(xì)胞的生長需求，通常還需要加入一定量的天然培養(yǎng)基予以補(bǔ)充。動物細(xì)胞的培養(yǎng)方式⒈懸浮培養(yǎng)讓細(xì)胞自由的懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)生長繁殖。⒉貼壁培養(yǎng)讓細(xì)胞貼附在某種基質(zhì)上生長繁殖的培養(yǎng)方法。⒊貼壁-懸浮培養(yǎng)⑴微載體培養(yǎng)⑵包埋和微囊培養(yǎng)⑶結(jié)團(tuán)培養(yǎng)1、懸浮培養(yǎng)適合非貼壁依賴細(xì)胞、兼性貼壁細(xì)胞操作簡便、培養(yǎng)條件均一、傳質(zhì)和傳氧較好、易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模細(xì)胞體積小、難采用灌流培養(yǎng)、細(xì)胞密度低通氣攪拌罐式與氣升式生物反應(yīng)器2、貼壁培養(yǎng)適合貼壁細(xì)胞、兼性貼壁細(xì)胞優(yōu)/缺點(diǎn)與懸浮培養(yǎng)相反在傳代或擴(kuò)大培養(yǎng)時需要酶將細(xì)胞從基質(zhì)上消化下來（胰酶、二乙烯四乙酸鈉/EDTA、胰酶-檸檬酸鹽、胰酶-EDTA、膠原酶、鏈霉蛋白酶、木瓜酶等）3、貼壁-懸浮培養(yǎng)（1）微載體培養(yǎng)擴(kuò)大貼附面積、保持懸浮狀態(tài)葡聚糖類、聚苯乙烯類、膠原類動物細(xì)胞微載體培養(yǎng)技術(shù)貼壁依賴型細(xì)胞在微載體表面上的增殖，要經(jīng)歷粘附和貼壁、生長及擴(kuò)展成單層3個階段。提高細(xì)胞與微載體表面的相溶性，是提高細(xì)胞貼壁速率和貼壁比率的必要條件。動物細(xì)胞在生理pH條件下通常帶負(fù)電荷，微載體需采用特殊處理技術(shù)使顆粒表面帶正電荷，具可潤濕性。用血清蛋白或合成蛋白、聚糖氨酸等物質(zhì)包被于微載體表面，可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。微載體有實(shí)心微載體和大孔微載體兩大類。大孔微載體培養(yǎng)動物細(xì)胞類似于包埋培養(yǎng)，細(xì)胞在孔內(nèi)生長，具有很高的安全性，攪拌引起的剪切損傷已不成為主要考慮的因素。理想微載體：表面性質(zhì)與細(xì)胞相容性好，