專題1 基因工程上課

專題1基因工程基因工程又叫基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。該技術(shù)是在生物體外，通過對(duì)DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的生物類型和生物產(chǎn)品。一、基因工程的概念基因工程的別名操作環(huán)境操作對(duì)象操作水平基本過程實(shí)質(zhì)結(jié)果基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)生物體外基因DNA分子水平人類需要的生物類型和生物產(chǎn)品剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)基因重組基本工具：限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合針”基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運(yùn)輸車”二、DNA重組技術(shù)的基本工具黏性末端黏性末端黏性末端：被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。1、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。(6個(gè),4、5、8個(gè))主要是從原核生物中分離純化出來的一種酶。4000種。（1）來源：（2）種類：（3）作用：（4）結(jié)果：形成兩種末端黏性末端平末端1、限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”（小結(jié)）1、種類：2、作用部位：E·coliDNA連接酶（黏性末端）T4DNA連接酶（黏性末端和平末端）磷酸二酯鍵DNA連接酶可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即把梯子兩邊扶手的斷口連接起來，這樣一個(gè)重組的DNA分子就形成了。2、DNA連接酶——“分子縫合針”3、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體——“分子運(yùn)輸車”（1）運(yùn)載體的作用作為運(yùn)載工具，將外源基因(抗蟲基因)轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)中去。利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞(棉花細(xì)胞)內(nèi)，對(duì)外源基因(抗蟲基因)進(jìn)行大量復(fù)制。（隨載體的復(fù)制而復(fù)制）（2）作為運(yùn)載體必須具備的條件能夠在宿主細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定地保存。具有一個(gè)或多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害。大小應(yīng)適合，便于提取和操作（3）常用的運(yùn)載體

3、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的運(yùn)載體——“分子運(yùn)輸車”細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒λ噬菌體的衍生物動(dòng)植物病毒注意：真正用作運(yùn)載體的質(zhì)粒都是人工改造過的。（補(bǔ)充知識(shí)）基因的結(jié)構(gòu)1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。②轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。③轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子2、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子內(nèi)含子：外顯子：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子啟動(dòng)子與起始密碼啟動(dòng)子起始密碼位置DNA上基因的非編碼區(qū)，在編碼區(qū)上游段（左側(cè)）位于mRNA上的開始即單鏈信使RNA（轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）功能轉(zhuǎn)錄時(shí)與RNA聚合酶結(jié)合，對(duì)轉(zhuǎn)錄mRNA起調(diào)控作用。是翻譯的開始，是肽鏈延伸的第一個(gè)氨基酸的位點(diǎn)。二、基因工程基本操作的四個(gè)步驟目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定（一）目的基因的獲取1、目的基因主要是指______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成未知序列已知序列（1）從基因文庫中獲取目的基因：基因文庫:

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)基因組文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.①概念：PCR全稱為_______________，是在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、_______________、___________(做啟動(dòng)子)、__________

等前提條件：。②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制已知基因的核苷酸序列四種脫氧核苷酸一對(duì)引物TaqDNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因雙鏈的解開⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈（3）人工合成反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)（3）人工合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同質(zhì)粒DNA分子一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶處理同一種4.過程:（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心5.基因表達(dá)載體的組成：復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(三)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化——方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)四環(huán)素抗性基因氨芐青霉素抗性基因(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功DNA分子雜交示意圖采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。(四)目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—鑒定——①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等過程:A.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNAB.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針C.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中方法:DNA分子雜交方法:分子雜交方法:抗原抗體雜交過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了Mrna.（補(bǔ)充知識(shí)）基因的結(jié)構(gòu)1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子①RNA聚合酶能夠識(shí)別調(diào)控序列中的結(jié)合位點(diǎn)，并與其結(jié)合。②轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動(dòng)，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。③轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子2、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)含子外顯子啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子內(nèi)含子：外顯子：真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子三、基因工程的應(yīng)用1、抗蟲轉(zhuǎn)基因植物方法：從某些生物中分離出具有殺蟲活性的基因，將其導(dǎo)入農(nóng)作物中，使其具有抗蟲性Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因等（一）植物基因工程碩果累累2、抗病轉(zhuǎn)基因生物目的基因包括：病毒外殼蛋白基因、病毒的復(fù)制酶基因、抗真菌轉(zhuǎn)基因植物中的有幾丁質(zhì)酶基因和抗毒素合成基因3、抗逆轉(zhuǎn)基因作物4、利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)

方法：將必需氨基酸含量多的蛋白質(zhì)編碼基因，導(dǎo)入植物中，或者改變這些氨基酸合成途徑中某種酶的活性。1、用于提高動(dòng)物生長速度

2、用于改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)目的基因：生長激素基因（二）動(dòng)物基因工程前景廣闊舉例:將腸乳糖酶基因?qū)肽膛；蚪M，獲得轉(zhuǎn)基因牛，其他營養(yǎng)不變的情況下，乳糖含量大大降低。3、用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物---動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器獲取目的基因（例如血清蛋白基因）構(gòu)建基因表達(dá)載體（在血清白蛋白基因前加特異表達(dá)