光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)快速檢測總前列腺特異性抗原

光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)快速檢測總前列腺特異性抗原

前列腺特異性抗體（psa）是一種由前列腺上皮細(xì)胞產(chǎn)生的大約34天的大型單鏈糖蛋白。它是精子的主要成分，血液中含量小，有很高的組織和器官特異性。腫瘤發(fā)生時(shí),前列腺和淋巴系統(tǒng)間組織屏障破壞,前列腺內(nèi)容物進(jìn)入血循環(huán),血中PSA含量升高,因此測定血清中PSA含量在前列腺癌的早期診斷、療效觀察和預(yù)后判斷等方面具有重要價(jià)值,被認(rèn)為是目前診斷前列腺癌最敏感的指標(biāo)。常用的檢測方法有定性的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、定量的化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)、放射免疫分析法(RIA)以及時(shí)間分辨熒光免疫法(TRFIA)等。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(AlphaLISA)技術(shù)起源于LOCI(luminescentoxygenchannelingimmunoassay)技術(shù),因其獨(dú)特的檢測方法,使整個(gè)過程靈敏度高,線性范圍寬,特異性強(qiáng),性質(zhì)穩(wěn)定、上樣量少,免洗板,快速簡便、易于微型化自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),是超微量檢測分析的又一工具。本研究采用該新型技術(shù),并運(yùn)用雙抗體夾心法快速檢測血清中總前列腺特異性抗原(tPSA),并與其他檢測tPSA試劑盒比較,進(jìn)行初步臨床評(píng)價(jià)。1材料和方法1.1儀器和試劑兩株配對(duì)tPSA單克隆抗體為芬蘭medix公司產(chǎn)品,tPSA抗原購自美國Biodesign公司;tPSA質(zhì)控血清為美國Biorad產(chǎn)品;生物素購自于Sigma公司;受體微球、鏈霉親和素化的供體微球和96孔微孔板為美國PerkinElmer公司產(chǎn)品;檢測儀為美國PerkinElmer公司的2300EnSpireTM檢測儀?？侾SA時(shí)間分辨免疫熒光檢測試劑盒(TRFIA)來自廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。45例陰性樣本、45例陽性樣本、136份血清樣本和386份正常人血清皆來自廣州南方醫(yī)院。1.2方法1.2.1稀釋液的制備稀釋tPSA抗原至濃度分別為0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、150ng/ml系列濃度,稀釋液為含50mmol/LTris-HCl,1.5%BSA,0.9%NaCl,0.05%NaN3,0.01%Tween-20,pH7.8的反應(yīng)緩沖液。1.2.2抗體反應(yīng)時(shí)間的合成將0.2mgtPSA抗體加入Millipore公司的帶有濾膜的離心管中,以9000×g離心8min,用緩沖液(0.13mol/L,pH8.0PBS)重復(fù)洗滌6次后收集抗體,在抗體溶液中加入1mg受體微球、10μl25mg/mlNaBH3CN(用緩沖液配制,現(xiàn)配現(xiàn)用)、1.25μl10%Tween-20,而后用緩沖液將體積補(bǔ)充到200μl,37℃避光振蕩反應(yīng)48h。最后加入10μl65mg/mlCMO(用0.8mol/LNaOH配制,現(xiàn)配現(xiàn)用)。37℃避光孵育1h封閉未結(jié)合位點(diǎn),離心洗滌,得到已連接抗體的受體微球,調(diào)整受體微球濃度為5mg/ml。1.2.3抗體溶液的配制將0.5mg抗體加入到Millipore公司帶有濾膜的離心管中,以9000×g離心8min,每次用200μl緩沖液(0.1mol/LNa2CO3/NaHCO3,pH9.5),重復(fù)洗滌6次后收集抗體,調(diào)整抗體濃度為20mg/ml。在抗體溶液中加入2μl22mg/ml生物素(用DMSO配制,現(xiàn)配現(xiàn)用),室溫振動(dòng)孵育4h。利用PBS(pH7.4)4℃透析24h,每6h換液1次,收集透析袋中液體,將其抗體濃度調(diào)整為0.5mg/ml。1.2.4檢測信號(hào)值的測定將5μl標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測樣品加入微孔板中,并分別加入以分析緩沖液1∶50比例稀釋的已連接抗體的受體微球25μl、1∶300比例稀釋的生物素化抗體25μl,37℃振動(dòng)孵育15min,然后在避光條件下加入鏈霉親和素化的供體微球175μl,37℃振動(dòng)孵育15min后在2300EnSpireTM檢測儀上檢測信號(hào)值。2結(jié)果2.1tpsa光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑的劑量—?jiǎng)┝?反應(yīng)曲線以自制試劑盒中參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),信號(hào)值1×103計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理,測得tPSA試劑盒劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)為r=0.999(圖1),表明自制tPSA光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑具有良好的劑量反應(yīng)。當(dāng)濃度升高時(shí),出現(xiàn)HOOK效應(yīng)(圖2)。2.2回收率的測定將Biorad的質(zhì)控品Ⅰ、Ⅲ及Ⅰ與Ⅲ等體積混合液分別進(jìn)行測定,各設(shè)三個(gè)復(fù)孔,計(jì)算質(zhì)控品的回收率。即質(zhì)控品Ⅰ與Ⅲ等體積混合液測定值與(質(zhì)控品Ⅰ+Ⅲ)/2的比值。結(jié)果見表1,自制試劑回收率為99.79%,符合準(zhǔn)確度要求。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的靈敏度以零參考標(biāo)準(zhǔn)品測定值(n=20)的均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差后得到信號(hào)值,將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得為分析靈敏度,其值為0.006ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍0.006~150ng/ml。2.4重復(fù)測定實(shí)驗(yàn)采用美國Biorad公司提供tPSA低、中、高三個(gè)質(zhì)控品(編號(hào)分別為54501、54502、54503),各設(shè)10個(gè)復(fù)孔,同一次實(shí)驗(yàn)內(nèi)和不同實(shí)驗(yàn)中重復(fù)多次測定。自制試劑分析內(nèi)變異系數(shù)為3.90%~6.67%,分析間變異系數(shù)為4.70%~6.90%,精密度良好(表2、表3)。2.5特異性將一定濃度的AFP,CA12-5,CA19-9,人白蛋白作為樣品用自制tPSA試劑測定,結(jié)果見表4。2.6濃度為4.0酸386份正常人血清,檢測最低值為0ng/ml,最高值為6.25ng/ml,平均濃度為1.32ng/ml,標(biāo)準(zhǔn)差為1.27ng/ml。從表5可見,在濃度值為4.00ng/ml以下時(shí),包含了98.2%的樣本。綜合他人的研究及臨床現(xiàn)行參考,我們建議設(shè)定本試劑檢測時(shí)的tPSA血清正常參考值范圍為0~4.00ng/ml。使用時(shí)根據(jù)各地區(qū)樣本的差異,建議設(shè)定自己的參考值范圍。2.7自制試劑檢測結(jié)果陰、陽性血清標(biāo)本各45份,分別用自制tPSA光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑和羅氏電化學(xué)發(fā)光診斷試劑盒tPSA進(jìn)行測定,結(jié)果顯示,兩種診斷試劑的陽性符合率和陰性符合率均為100%,說明自制試劑用于臨床檢測時(shí)準(zhǔn)確度高。兩種檢測方法所得陰、陽性血樣數(shù)值有顯著相關(guān)性,AlphaLISA=1.187ECL+0.01,r=0.987,P<0.001(圖3)。136份臨床血樣同時(shí)用自制試劑與ECLIA進(jìn)行平行檢測,對(duì)所測數(shù)值進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示兩種方法所得的數(shù)值有顯著相關(guān)性,AlphaLISA=1.141ECL-1.005,r=0.979,P<0.001(圖4)。比較常用方法的檢測性能(表6),可以看出光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑在檢測性能指標(biāo)上與電化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒、時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒無明顯差異。3光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法psa法的應(yīng)用PSA是一種絲氨酸蛋白酶,屬于激肽釋放酶家族,能快速水解大分子精液中的凝固蛋白,具有酶活性的PSA主要受蛋白酶抑制劑的調(diào)節(jié)。a1抗糜蛋白酶(anti-chymotrysin)和a2巨球蛋白(a2-macroglobulin)是肝臟產(chǎn)生的兩種主要絲氨酸蛋白酶抑制劑,PSA與它們分別結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)合物(PSA-ACT和PSA-AMG)而失去酶的活性。其中與ACT結(jié)合是血清中PSA復(fù)合體的主要形式,與a2巨球蛋白結(jié)合的PSA由于不具有免疫活性而不能被測定。除結(jié)合型PSA外,血清中還存在較少比例的游離型PSA(20%),游離型PSA(fPSA)即活性PSA形式。臨床上測定總PSA包括血清中游離型PSA和結(jié)合型PSA(PSA-ACT)。目前臨床所用的檢測試劑大多為進(jìn)口試劑,費(fèi)用貴,不利于臨床廣泛應(yīng)用,限制了前列腺增生、前列腺癌等疾病所要求的早期診斷、早期治療,尤其是在接近c(diǎn)ut-off值(灰區(qū))區(qū)域內(nèi),準(zhǔn)確檢測血清中tPSA的含量,對(duì)疾病分型,隨后的治療方案選擇有很重要的參考意義。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法是一種通過化學(xué)發(fā)光檢測微球間的結(jié)合,進(jìn)而檢測分析物含量的方法。在680nm的光照下,供體微球中的光敏物質(zhì)受到激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧,單線態(tài)氧擴(kuò)散至受體微球,與其中的發(fā)光物質(zhì)反應(yīng)后產(chǎn)生615nm的化學(xué)發(fā)光。由于單線態(tài)氧在溶液中維持活性的時(shí)間很短(約4μs),只能擴(kuò)散約200nm的距離,因此只有那些通過待測物質(zhì)連接在一起的受體微球和供體微球才能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了均相免疫測定,操作過程簡便,避免了酶聯(lián)免疫吸附法、時(shí)間分辨熒光免疫分析法等檢測方法中的分離和洗滌過程,耗時(shí)短,可在35min內(nèi)完成,完全可用于臨床急診檢測。且比以往的非均相免疫分析(如ELISA、時(shí)間分辨熒光免疫分析)省樣本(低至5μl),操作簡便,更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、小型化;整個(gè)操作過程不易受pH值,溫度等外界因素的干擾,保證了檢測的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。本研究旨在應(yīng)用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法來定量檢測人血清中的tPSA。有文獻(xiàn)報(bào)道tPSA含量年增高值>1μg/L就有意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,分析靈敏度為0.006ng/ml,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國外電化學(xué)發(fā)光試劑的0.05ng/ml,不僅能節(jié)約待測樣品(只需5μl),也有利于減少樣品對(duì)分析系統(tǒng)的干擾。檢測上限低于進(jìn)口電化