高效液相色譜法測定苯甲酸阿格列汀片的含量

高效液相色譜法測定苯甲酸阿格列汀片的含量

苯乙烯-金屬絲是日本拿達公司開發(fā)的一種絲氨酸酶誘導劑（dpp-a），它可以維持體內(nèi)胰高血糖素1（glp-1）和葡萄糖對胰島素濃度（gip）的依賴，促進胰島素的分泌，發(fā)揮抗糖作用。2010年4月該藥獲得日本厚生勞動省的上市批準,商品名Nesina。蘇州大學實驗材料供應中心與南京佳核鑫醫(yī)藥科技有限公司目前正在進行苯甲酸阿格列汀原料藥和制劑的研究與協(xié)作申報,該藥屬于化學藥3.1類新藥。由于國外新藥的質(zhì)量標準屬于技術保密,目前苯甲酸阿格列汀的含量測定未見有文獻報道。為控制該藥質(zhì)量,本文建立了測定苯甲酸阿格列汀片含量的高效液相色譜(HPLC)法,以為該制劑的質(zhì)量評價和標準建立提供依據(jù)。1材料表面1.1紫外-可見分光光度計HPLC儀(LC-10AT泵、SPD-10Avp紫外檢測器)、LCsolution色譜工作站、UV-2401PC紫外-可見分光光度計(日本Shimadzu公司)。1.2片的規(guī)格規(guī)格苯甲酸阿格列汀片(南京佳核鑫醫(yī)藥科技有限公司制劑室,批號:121101、121102、121103,規(guī)格:每片25mg);苯甲酸阿格列汀對照品(蘇州卡耐博生物技術有限公司,批號:121027,純度:99.66%);乙腈為色譜純,其余試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1流動相、纖維素-乙腈kh2po4-磷酸調(diào)ph3.0色譜柱:KromasilC18(250mm×4.6mm,5μm);流動相:0.05mol/L的KH2PO4溶液(磷酸調(diào)pH3.0)-乙腈(65∶35),流速:1.0ml/min;檢測波長:224nm;柱溫:室溫;進樣量:20μl。2.2續(xù)濾液的制備供試品溶液:取苯甲酸阿格列汀片劑粉末適量,約相當于苯甲酸阿格列汀10mg,精密稱定,置于100ml量瓶中,用流動相溶解并稀釋至刻度,過濾,取續(xù)濾液即得。對照品溶液:取苯甲酸阿格列汀對照品,用流動相溶解并制成每1ml中含苯甲酸阿格列汀100μg的溶液,即得。2.3理論板數(shù)和峰形對稱精密量取“2.2”項下對照品、供試品溶液各20μl進樣,并以空白輔料的流動相溶液作為對照。結(jié)果,苯甲酸阿格列汀的理論板數(shù)為14654,保留時間為8.433min,峰形對稱。色譜詳見圖1。2.4線性范圍的確定取苯甲酸阿格列汀對照品,用流動相溶解并稀釋制成苯甲酸阿格列汀質(zhì)量濃度分別為19.96、59.88、99.80、139.7、179.6μg/ml的溶液。精密量取上述溶液各20μl分別注入色譜儀,記錄色譜圖。以進樣質(zhì)量濃度(c)為橫坐標、苯甲酸阿格列汀的峰面積(A)為縱坐標進行線性回歸,得回歸方程為A=-6.7598×104+5.7178×104c(r=0.9999)。結(jié)果表明,苯甲酸阿格列汀檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為19.96~179.6μg/ml。以信噪比10計算,測得苯甲酸阿格列汀定量限為2ng。2.5對照品溶液的制備取苯甲酸阿格列汀對照品適量,按“2.2”項下方法制備成對照品溶液,連續(xù)進樣5次并測定。結(jié)果峰面積值的RSD=0.31%(n=5)。2.6樣品含量測定精密稱取同批樣品6份,按“2.2”項下方法制備供試品和對照品溶液,進樣20μl,分別測定每份樣品的含量。結(jié)果平均含量為99.87%,RSD=0.39%(n=6),表明本方法重復性良好。2.7進樣、測定取供試品溶液1份,分別于放置0、1、2、4、8、12h時進樣、測定。結(jié)果以峰面積計算RSD=0.47%(n=6),表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.8對照品回收率取同批樣品,按測試濃度的80%、100%、120%分別加入苯甲酸阿格列汀對照品各3份,照“2.9”項下同法操作,計算回收率,結(jié)果詳見表1。2.9測定項目含量取苯甲酸阿格列汀片劑粉末、對照品適量,按“2.2”項下方法分別制備成供試品、對照品溶液,分別進樣測定,記錄峰面積,并按外標法以峰面積計算含量。結(jié)果3批樣品占標示含量百分比分別為99.26%、99.87%、99.39%。3討論3.1紫外分光光度法前期試驗中,取苯甲酸阿格列汀對照品、片劑粉末、空白輔料以及合成各步中間體適量,分別用流動相配制成質(zhì)量濃度約為10μg/ml的各溶液,按紫外分光光度法操作,于200~400nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果對照品、供試品溶液中的主成分均于224、277nm波長處有最大吸收,合成各步中間體于224nm波長處均有最大吸收,輔料溶液在此處無吸收,故檢測波長確定為224nm。3.2流動相條件的驗證前期試驗中,通過對苯甲酸阿格列汀片(批號:121101)、各中間體及破壞后樣品的測定,發(fā)現(xiàn)采用常見的水-乙腈(50∶50)為流動相時,主成分峰形不好,很難洗脫出來;采用濃度為0.05mol/L的KH2PO4(未調(diào)pH值)溶液-乙腈(65∶35)為流動相時,主成分的峰前延很大;采用濃度為0.05mol/L的KH2PO4(用磷酸調(diào)pH3.0)溶液-乙腈(65∶35)為流動相時,阿格列汀的峰形對稱,與其有關物質(zhì)、各步中間體和降解產(chǎn)物均能得到很好的分離。苯甲酸阿格列汀片(批號:121101)在酸、堿、光、熱破壞下未見明顯降解產(chǎn)物,在氧化破壞下產(chǎn)生明顯的降解產(chǎn)物,且與離主成分峰最近的降解產(chǎn)物峰的分離符合要求,表明本法確立的流動相條件合適。色譜結(jié)果見圖2。3.3