微生物酶制劑生產(chǎn)工藝及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

微生物酶制劑生產(chǎn)工藝及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用制作人：馮華煒目錄微生物酶制劑的簡(jiǎn)介微生物酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)微生物酶制劑在食品工業(yè)中的應(yīng)用一、簡(jiǎn)介1、定義酶制劑是指從生物中提取的具有酶特性的一類(lèi)物質(zhì)，酶制劑主要作用是催化食品加工過(guò)程中各種化學(xué)反應(yīng)，改進(jìn)食品加工方法。是一類(lèi)從動(dòng)物、植物、微生物中提取具有生物催化能力的蛋白質(zhì)。微生物酶制劑就是從微生物中提取的蛋白質(zhì)。

2、微生物酶生產(chǎn)發(fā)展概況1894年，日本科學(xué)家首次從米曲霉中提煉出淀粉酶，并將淀粉酶用作治療消化不良的藥物，從而開(kāi)創(chuàng)了人類(lèi)有目的地生產(chǎn)和應(yīng)用酶制劑的先例。1911年，美國(guó)科學(xué)家從木瓜中提取出木瓜蛋白酶，并將木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白質(zhì)渾濁物。此后，酶制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用就逐步發(fā)展起1949年，科學(xué)家成功地用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)出了細(xì)菌α－淀粉酶，從此揭開(kāi)了近代酶工業(yè)的序幕。1971年，第一次國(guó)際酶工程學(xué)術(shù)會(huì)議在美國(guó)召開(kāi)，會(huì)議的主題就是固定化酶的研制和應(yīng)用。20世紀(jì)70年代后期，酶工程領(lǐng)域又出現(xiàn)了固定化細(xì)胞技術(shù)。1986年，我國(guó)科學(xué)家利用固定化原生質(zhì)體發(fā)酵生產(chǎn)堿性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相繼獲得成功，為酶工程的進(jìn)一步發(fā)展開(kāi)辟了新的途徑。近20年來(lái)，隨著基因工程的滲入，使酶的定向改造成為可能，所以在固定化酶、固定化細(xì)胞和固定化原生質(zhì)體發(fā)展的同時(shí)，酶分子修飾技術(shù)、酶的化學(xué)合成以及酶的人工合成等方面的研究，也在積極地開(kāi)展中，從而使酶工程更加顯示出廣闊而誘人的前景。

3、利用微生物提取酶制劑的意義及其優(yōu)點(diǎn)酶是一種生物催化劑，催化效率高、反應(yīng)條件溫和和專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，已經(jīng)日益受到人們的重視，應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。生物界中已發(fā)現(xiàn)有多種生物酶，在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的僅有淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、脂肪酶、纖維素酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶等十幾種。利用微生物生產(chǎn)生物酶制劑要比從植物瓜果、種子、動(dòng)物組織中獲得更容易。因?yàn)閯?dòng)、植物來(lái)源有限，且受季節(jié)、氣候和地域的限制，而微生物不僅不受這些因素的影響，而且種類(lèi)繁多、生長(zhǎng)速度快、加工提純?nèi)菀住⒓庸こ杀鞠鄬?duì)比較低，充分顯示了微生物生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)越性。

利用微生物產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)是：(1)微生物種類(lèi)多、酶種豐富，且菌株易誘變，菌種多樣。(2)微生物生長(zhǎng)繁殖快，易提取酶，特別是胞外酶。(3)微生物培養(yǎng)基來(lái)源廣泛、價(jià)格便宜。(4)可以采用微電腦等新技術(shù)，控制酶發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程，生產(chǎn)可連續(xù)化、自動(dòng)化，經(jīng)濟(jì)效益高。(5)可以利用以基因工程為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，選育菌種、增加酶產(chǎn)率和開(kāi)發(fā)新酶種。二、微生物酶的生產(chǎn)技術(shù)二級(jí)種子一級(jí)種子三角瓶種子斜面菌種培養(yǎng)基滅菌接種固體發(fā)酵液體發(fā)酵空氣壓縮過(guò)濾濃縮酶液干燥酶粉提取酶液圖1.微生物酶制劑的生產(chǎn)工藝（一）、產(chǎn)酶微生物

生產(chǎn)酶制劑的微生物有絲狀真菌、酵母、細(xì)菌3大類(lèi)群，主要是用好氣菌。幾種主要工業(yè)酶的菌種和使用情況如下：

淀粉酶類(lèi)、蛋白酶、葡糖異構(gòu)酶、其他重要工業(yè)用酶（二）、酶的生產(chǎn)方法

酶的生產(chǎn)是指經(jīng)過(guò)預(yù)先設(shè)計(jì)，并且通過(guò)人工控制而獲得所需要的酶的過(guò)程。概括地說(shuō)，酶的生產(chǎn)方法有提取法、發(fā)酵法和化學(xué)合成法三種。提取法是最早采用并且一直沿用至今的一種方法。它采用各種技術(shù)，直接從動(dòng)植物或微生物的細(xì)胞或組織中將酶提取出來(lái)。提取法雖簡(jiǎn)單易行，但必須要有充足的原材料，這就使提取法的廣泛應(yīng)用受到了限制。發(fā)酵法是20世紀(jì)50年代以來(lái)生產(chǎn)酶的主要方法。它主要通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)獲得人們所需要的酶。發(fā)酵法一般包括固體發(fā)酵、液體深層發(fā)酵、固定化細(xì)胞發(fā)酵和原生質(zhì)體發(fā)酵等多種方式。化學(xué)合成法是20世紀(jì)60年代末出現(xiàn)的一種生產(chǎn)酶的新技術(shù)，目前仍然停留在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)合成的階段。1.菌種選擇

微生物發(fā)酵生產(chǎn)酶的方法同其他發(fā)酵行業(yè)類(lèi)似，首先必須選擇合適的產(chǎn)酶菌株，然后采用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)方式進(jìn)行發(fā)酵，使微生物生長(zhǎng)繁殖并合成大量所需的酶，最后將酶分離純化制成一定的酶制劑。

（三）、微生物酶制劑生產(chǎn)任何生物都能在一定的條件下合成某些酶。但并不是所有的細(xì)胞都能用于酶的發(fā)酵生產(chǎn)。一般說(shuō)來(lái)，能用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)胞必須具備如下幾個(gè)條件：

酶的產(chǎn)量高

優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞首先具有高產(chǎn)的特性，才有較好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。高產(chǎn)細(xì)胞可以通過(guò)篩選、誘變、或采用基因工程、細(xì)胞工程等技術(shù)而獲得；容易培養(yǎng)和管理，要求產(chǎn)酶細(xì)胞容易生長(zhǎng)繁殖，并且適應(yīng)性較強(qiáng)，易于控制，便于管理。

產(chǎn)酶穩(wěn)定性好在通常的生產(chǎn)條件下，能夠穩(wěn)定地

用于生產(chǎn)，不易退化。一旦細(xì)胞退化，要經(jīng)過(guò)復(fù)壯處理，使其恢復(fù)產(chǎn)酶性能。利于酶的分離純化發(fā)酵完成后，需經(jīng)分離純化過(guò)程，才能得到所需的酶，這就要求產(chǎn)酶細(xì)胞本身及其它雜質(zhì)易于和酶分離。安全可靠要使用的細(xì)胞及其代謝物安全無(wú)毒，不會(huì)影響生產(chǎn)人員和環(huán)境，也不會(huì)對(duì)酶的應(yīng)用產(chǎn)生其它不良的影響。2、產(chǎn)酶培養(yǎng)

酶的發(fā)酵生產(chǎn)是以獲得大量所需的酶為目的。為此，除了選擇性能優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞以外，還必須滿足細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶的各種工藝條件，并要根據(jù)發(fā)酵過(guò)程的變化進(jìn)行優(yōu)化控制。1)

固體培養(yǎng)法

固體培養(yǎng)是以麩皮或米糠為主要原料，另外添加谷糠、豆餅等為輔助原料。經(jīng)過(guò)對(duì)原料發(fā)酵前處理，在一定的培養(yǎng)條件下微生物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖代謝產(chǎn)酶。固體培養(yǎng)法比液體培養(yǎng)法產(chǎn)酶量高。同時(shí)還具有原料簡(jiǎn)單、不易污染、操作簡(jiǎn)便、酶提取容易、節(jié)省能源等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是不便自動(dòng)化和連續(xù)化作業(yè)，占地多、勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)周期長(zhǎng)。

2)液體培養(yǎng)法

液體培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)是：占地少、生產(chǎn)量大、適合機(jī)械化作業(yè)、發(fā)酵條件容易控制、不易污染，還可大大減輕勞動(dòng)強(qiáng)度。其培養(yǎng)方法有分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)三種，其中前兩種培養(yǎng)法廣為應(yīng)用，后者因污染和變異等關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題尚未解決，應(yīng)用受到限制。3)

產(chǎn)酶條件的控制

（1）培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分是微生物發(fā)酵產(chǎn)酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子和產(chǎn)酶促進(jìn)劑等。①碳源碳素是構(gòu)成菌體成分的主要元素，也是細(xì)胞貯藏物質(zhì)和生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物的骨架，還是菌體生命活動(dòng)的能量的主要來(lái)源。當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)上使用的菌種大都是只能利用有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。有機(jī)碳的主要來(lái)源有：一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。

不同的細(xì)胞對(duì)各種碳源的利用差異很大，所以在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇合適的碳源。另外，選擇碳源除考慮營(yíng)養(yǎng)要求外，還要考慮酶生物合成的誘導(dǎo)作用和是否存在分解代謝物阻遏作用。盡量選用具有誘導(dǎo)作用的碳源，盡量不用或少用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，α－淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，應(yīng)該選用有誘導(dǎo)作用的淀粉作為碳源，而不用對(duì)該酶有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。②氮源氮是生物體內(nèi)各種含氮物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等的組成成分。酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源兩種，常用的有機(jī)氮源有：豆餅、花生餅、菜籽餅、魚(yú)粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；無(wú)機(jī)氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。不同的細(xì)胞對(duì)各種氮源的要求各不相同，應(yīng)根據(jù)要求進(jìn)行選擇和配制。一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物細(xì)胞要求有機(jī)氮，植物細(xì)胞主要要求無(wú)機(jī)氮。多數(shù)情況下將有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源配合使用才能取得較好的效果。例如黑曲霉酸性蛋白酶生產(chǎn)，只用銨鹽或硝酸鹽為氮源時(shí)，酶產(chǎn)量?jī)H為有胨時(shí)的30%。只用有機(jī)氮源而不用無(wú)機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)量也低，故一般除使用高濃度有機(jī)氮源外尚需添加1%~3%的無(wú)機(jī)氮源。③碳氮比在微生物酶生產(chǎn)培養(yǎng)基中碳源與氮源的比例是隨生產(chǎn)的酶類(lèi)、生產(chǎn)菌株的性質(zhì)和培養(yǎng)階段的不同而改變的。一般蛋白酶(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生產(chǎn)采用由豆餅粉3.75%、玉米粉0.625%、魚(yú)粉0.625%。NH4Cl1%、CaCl20.5%、Na2HP040.2%、豆餅石灰水解液10%組成的培養(yǎng)基；淀粉酶(包括α－淀粉酶、糖化酶、β－淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高，例如枯草桿菌TUD127α－淀粉酶生產(chǎn)采用由豆餅粉4%、玉米粉8%、Na2HP040.8%、(NH4)2SO40.4%、CaCl20.2%組成的培養(yǎng)基。而在淀粉酶生產(chǎn)中糖化酶生產(chǎn)培養(yǎng)基的碳氮比是最高的。以上是蛋白酶和淀粉酶生產(chǎn)培養(yǎng)基碳氮比的一般規(guī)律，但是由于菌種很多而其性質(zhì)各異。很難說(shuō)都是符合上述規(guī)律的。在微生物酶生產(chǎn)過(guò)程中，培養(yǎng)基的碳氮比也因培養(yǎng)過(guò)程不同而異。例如種子培養(yǎng)時(shí)，為了適應(yīng)菌體生長(zhǎng)繁殖的需要，要求提供合成細(xì)胞蛋白質(zhì)的氮多些，容易利用的氮源的比例大些，種子培養(yǎng)基的碳氮比一般要比發(fā)酵培養(yǎng)基低些。發(fā)酵時(shí)，不同發(fā)酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF－7658生產(chǎn)α－淀粉酶的發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵前期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)降低，以利菌體生長(zhǎng)繁殖，發(fā)酵中后期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)提高，以促進(jìn)淀粉酶的生成。④無(wú)機(jī)鹽微生物酶生產(chǎn)和其他微生物產(chǎn)品生產(chǎn)一樣，培養(yǎng)基中需要有磷酸鹽及硫、鉀、鈉、鈣、鎂等元素存在。在酶生產(chǎn)中常以磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀等磷酸鹽作為磷源，以硫酸鎂為硫源和鎂源。鈣離子對(duì)淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多種酶的活性有十分重要的穩(wěn)定作用，例如在無(wú)Ca2+存在時(shí)灰色鏈霉菌中性蛋白酶只在pH7-7.5很小范圍內(nèi)穩(wěn)定，當(dāng)有Ca2+存在時(shí)穩(wěn)定pH范圍可以擴(kuò)大到5-7。鈉離子有控制細(xì)胞滲透壓使酶產(chǎn)量增加的作用，酶生產(chǎn)的培養(yǎng)基中有時(shí)以磷酸氫二鈉及硝酸鈉等形式加入，例如米曲霉α－淀粉酶生產(chǎn)，添加適量的硝酸鈉以促進(jìn)酶生產(chǎn)。在天然培養(yǎng)基中，一般微量元素不必另外加入，但也有一些例外。如玉米粉、豆粉為碳源時(shí)，添加100ppmCo2+和Zn2+，放線菌166蛋白酶活力可增加70%-80%。⑤生長(zhǎng)因子

微生物還需一些微量的像維生素一類(lèi)的物質(zhì)，才能正常生長(zhǎng)發(fā)育，這類(lèi)物質(zhì)統(tǒng)稱生長(zhǎng)因子(或生長(zhǎng)素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長(zhǎng)因子，大多是由天然原料提供，如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長(zhǎng)素32-128mg/mL。⑥產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指在培養(yǎng)基中添加某種少量物質(zhì)，能顯著提高酶的產(chǎn)率，這類(lèi)物質(zhì)稱為產(chǎn)酶促進(jìn)劑。產(chǎn)酶促進(jìn)劑大體上分為兩種：一是誘導(dǎo)物，二是表面活性劑。表面活性劑，如吐溫－80的濃度為0.1%時(shí)能增加許多酶的產(chǎn)量。表面活性劑能增加細(xì)胞的通透性，處在氣－液界面改善了氧的傳遞速度，還可以保護(hù)酶的活性。生產(chǎn)上常采用非離子型表面活性劑，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸類(lèi)、焦糖、羧甲基纖維素、苯乙醇等。離子型的表面活性劑對(duì)微生物有害。用于食品、醫(yī)藥的酶的生產(chǎn)中所用的表面活性劑還須對(duì)人、畜無(wú)害。此外各種產(chǎn)酶促進(jìn)劑的效果還受到菌種，種齡、培養(yǎng)基組成的影響。酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外，還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。(2)培養(yǎng)條件發(fā)酵溫度發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。微生物在生長(zhǎng)發(fā)育中，不斷地吸收培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分來(lái)合成菌體的細(xì)胞物質(zhì)和酶時(shí)的生化反應(yīng)都是吸熱反應(yīng)；培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量分解時(shí)的生化反應(yīng)都是放熱反應(yīng)。發(fā)酵初期合成反應(yīng)吸收的熱量大于分解反應(yīng)放出的熱量，發(fā)酵液需要升溫。當(dāng)菌體繁殖旺盛時(shí)，情況則相反，發(fā)酵液溫度就自行上升，加上通風(fēng)攪拌所帶來(lái)的熱量，這時(shí)，發(fā)酵液必須降溫，以保持微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶所需的適宜溫度。微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質(zhì)不同而異，生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。一般細(xì)菌為37℃，霉菌和放線菌為28-30℃，一些嗜熱微生物需在40~50℃下生長(zhǎng)繁殖，如紅曲霉生長(zhǎng)溫度35-37℃，而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為37-40℃。在酶生產(chǎn)中，為了有利于菌體生長(zhǎng)和酶的合成，也有進(jìn)行變溫生產(chǎn)的。例如以枯草桿菌ASl.398進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)時(shí)，培養(yǎng)溫度必須從31℃逐漸升溫至40℃，然后再降溫到31℃進(jìn)行培養(yǎng)，蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。據(jù)報(bào)道，酶生產(chǎn)的溫度對(duì)酶活力的穩(wěn)定性有影響，例如用嗜熱芽孢桿菌進(jìn)行α－淀粉酶生產(chǎn)時(shí)，在55℃培養(yǎng)所產(chǎn)生的酶的穩(wěn)定性比35℃好。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的pH直接影響酶的產(chǎn)量和質(zhì)量。在發(fā)酵過(guò)程中，微生物不斷分解和同化營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排出代謝產(chǎn)物。由于這些產(chǎn)物都與pH有直接關(guān)系，因此發(fā)酵液pH在不斷發(fā)生變化。生產(chǎn)上根據(jù)pH的變化情況常作為生產(chǎn)控制的根據(jù)。一般來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高，發(fā)酵液傾向于酸性，pH低；C/N低，發(fā)酵液傾向于堿性，pH高。pH的這些變化情況，常常引起細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)酶環(huán)境的變化，對(duì)產(chǎn)酶帶來(lái)不利的影響。因此生產(chǎn)中常采用一些控制pH的方法，通常有：添加緩沖液維持一定的pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量維持發(fā)酵液的氧化還原電位于一定范圍；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH，保持一定的C/N比；當(dāng)發(fā)酵液pH過(guò)高時(shí)用糖或淀粉來(lái)調(diào)節(jié)，pH過(guò)低時(shí)，通過(guò)氮調(diào)節(jié)。

pH對(duì)產(chǎn)酶的影響通風(fēng)量對(duì)產(chǎn)酶的影響其實(shí)通風(fēng)量的多少應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基中的溶解氧而定。一般來(lái)說(shuō)，在發(fā)酵初期，雖然幼細(xì)胞呼吸強(qiáng)度大，耗氧多，但由于菌體少，相對(duì)通風(fēng)量可以少些；菌體生長(zhǎng)繁殖旺盛期時(shí)，耗氧多，要求通風(fēng)量大些；產(chǎn)酶旺盛時(shí)的通風(fēng)量因菌種和酶種而異，一般需要強(qiáng)烈通風(fēng)；但也有例外，通風(fēng)量過(guò)多反而抑制酶的生成。因此，菌種、酶種、培養(yǎng)時(shí)期、培養(yǎng)基和設(shè)備性能都能影響通風(fēng)量，從而影響酶的產(chǎn)量。目前用于酶制劑生產(chǎn)的微生物都為好氣性微生物，生產(chǎn)上普遍采用自動(dòng)測(cè)定和記錄溶解氧的儀表。攪拌的影響對(duì)于好氣性微生物的深層發(fā)酵，除了需要通氣外，還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸，降低細(xì)胞周?chē)拇x產(chǎn)物，從而有利于新陳代謝。同時(shí)可打破空