基因操作技術(shù)原理

第二章基因操作的主要技術(shù)原理第一節(jié)核酸的凝膠電泳第二節(jié)擴(kuò)增原理(PCR)第三節(jié)分子雜交第四節(jié)測(cè)序一、原理二、分類:瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）

核酸的凝膠電泳是一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段，同時(shí)也是分子生物學(xué)研究方法的技術(shù)基礎(chǔ)。第一節(jié)核酸的凝膠電泳

帶有負(fù)電荷的核苷酸鏈（DNA或RNA），依靠無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的介質(zhì)（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場(chǎng)中以一定的遷移率從負(fù)極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構(gòu)型或形狀的差異，以及所帶電荷的不同，可以通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。一、原理

分子量較小的DNA分子，比分子量較大的DNA分子遷移率要快；

同等分子量的不同構(gòu)型的核酸分子，構(gòu)型緊密的比松散型的開環(huán)DNA分子或線性DNA分子遷移率要快電泳的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型SeparationRangeVs.%AgarosePolyAcrylamideGels瓊脂糖凝膠的分辨力在0.2～50Kb之間聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之間凝膠電泳的分辨力與凝膠的類型和密度相關(guān)

瓊脂糖是一種從紅色海藻中提取出的線性多糖聚合物。分為常熔點(diǎn)的瓊脂糖和低熔點(diǎn)（LMP）瓊脂糖。二、分類—瓊脂糖凝膠電泳低熔點(diǎn)（LMP）瓊脂糖的熔點(diǎn)在62～65℃，熔解后，在37℃可保持液態(tài)數(shù)小時(shí)；在25℃可保持液態(tài)約10min。可以用來回收DNA分子、直接酶切。

緩沖液：1×TAE（TBETPE）凝膠的含量：根據(jù)檢測(cè)的DNA大小加DNA樣品：<1μg，loaddingbuffer(指示劑)電泳條件：大片斷低電壓長(zhǎng)時(shí)間;小片段高電壓短時(shí)間染色和觀察：溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）染色，在300nm波長(zhǎng)的紫外下觀察（凝膠成像儀）?？煽吹?.05μg的微量DNA；DNA的片斷大小與熒光強(qiáng)度成正比

瓊脂糖凝膠電泳的參數(shù)Agarosegelelectrophoresis溴化乙錠（ethidiumbromide，EB）在放大的電泳照片上,以樣品槽為起點(diǎn),用卡尺測(cè)量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離,以厘米為單位。以核苷酸數(shù)的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),以遷移距離為橫坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上繪出連結(jié)各點(diǎn)的平滑曲線,即為該電泳條件下DNA分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在放大的電泳照片上,用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離,根據(jù)此數(shù)值,在DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的對(duì)數(shù)值,進(jìn)一步計(jì)算出各片段的分子量大小。二、分類－瓊脂糖凝膠電泳（RNA變性凝膠電泳）RNA由單鏈核苷酸組成，其局部可形成雙鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。因此欲測(cè)定RNA較準(zhǔn)確的分子大小，必須在變性條件下進(jìn)行電泳。其他同DNA電泳。RNA變性條件下進(jìn)行電泳，所使用的變性劑有甲醛、乙二醛、羥甲基汞、尿素和甲酰胺。尿素和甲酰胺通常用于RNA變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，因?yàn)樗鼈儠?huì)影響瓊脂糖固化。在瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，用選擇就是前三種。用甲醛變性電泳后若需將核酸轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上(如Narthern等)核酸需再經(jīng)NaOH變性，控制不當(dāng)易斷裂RNA，甲醛還有強(qiáng)烈的刺激性氣味。羥甲基汞是最理想的變性劑，但毒性大。因此，一般均選用乙二醛作變性劑。1、乙二醛的處理商品乙二醛為40%溶液(6M/L)。乙二醛中含少量的，乙二酸、乙醛酸和甲酸等氧化物。使用前必須經(jīng)強(qiáng)堿強(qiáng)酸混合型樹脂去離子，否則會(huì)把RNA降解。反復(fù)處理直至溶液pH值大于5.0為止。然后分裝小份。2、上樣前的變性處理(RNA變性處理)去離子乙二醛2.7μl，二甲基亞砜(DMSO)8.0μl，0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.0)1.6μl，RNA(1～20μg)3.7μl?；旌虾笤?0℃保溫1小時(shí)。再與4μl上樣指示劑混并立即電泳。3、染色染色最好能夠用30μg/ml吖啶橙浸膠。盡量少用或不用溴化乙錠，因?yàn)橐叶┛膳c溴化乙錠發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，改變溴化乙錠的光譜性質(zhì)。絕對(duì)應(yīng)禁止將溴化乙錠灌注膠內(nèi)。1.5%瓊脂糖分析小于1kb的RNA，1%瓊脂糖分析大于1kb的RNA分子。電泳緩沖液應(yīng)為10mM磷酸鈉電泳液。緩沖液：TBE凝膠聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/亞甲雙丙稀酰胺（29：1）；TEMED和過硫酸銨（10％）。二、分類—聚丙烯酰胺凝膠電泳丙烯酰胺單體

由過硫酸銨提供并可被TEMED(N，N，N′，N′—四甲基乙二胺)所穩(wěn)定的自由基激發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，使丙烯酰胺聚成長(zhǎng)鏈。雙功能基因團(tuán)，N，N′—亞甲雙丙烯酰胺參與聚合反應(yīng)時(shí)，鏈與鏈之間均勻交聯(lián)成凝膠，其孔徑由鏈長(zhǎng)和交聯(lián)度決定。N，N′—亞甲雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)的聚丙烯酰胺結(jié)構(gòu)如下：共價(jià)交聯(lián)孔徑大小由鏈長(zhǎng)和交聯(lián)度所決定，即丙烯酰胺的濃度。TBE緩沖體系染色-銀染（AgNO3）1984年,D.Schwartz&C.Centor發(fā)明，DNA分子的螺旋半徑超過凝膠分子孔徑。二、分類—脈沖電場(chǎng)凝膠電泳（PFGE—pulse-fieldgelelectrophoresis）能夠分離超大分子量的DNA分子（107bp）。在脈沖電泳中，電場(chǎng)方向是周期變化的，頭一個(gè)脈沖電場(chǎng)方向與核酸的移動(dòng)方向成45℃角，下一個(gè)脈沖的電場(chǎng)方向與核酸移動(dòng)方向在另一側(cè)成45℃角，由于加在瓊脂糖凝膠電泳上的電場(chǎng)方向、電流大小、以及作用時(shí)間都在交替地變換著，這就使得DNA分子必須隨時(shí)調(diào)整其泳動(dòng)的方向，來適應(yīng)凝膠孔隙的無規(guī)則變化。電泳方向與分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要較多的次數(shù)來更換其構(gòu)型和方位，使之能夠按新的方向游動(dòng)，所以遷移率就慢，從而達(dá)到了分離大分子量DNA分子的目的。PFGEcanresolvelargeDNAfragmentsback一、PCR技術(shù)原理二、PCR技術(shù)的應(yīng)用第二節(jié)擴(kuò)增的原理（PCR）基因擴(kuò)增（geneamplification）

1.體外擴(kuò)增(PCR)2.通過體外重組和轉(zhuǎn)化，將目的基因在宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增3.在環(huán)境作用下，生物體內(nèi)相關(guān)基因的擴(kuò)增4.程序基因擴(kuò)增（programmeedgeneamplification）

真核生物特定發(fā)育階段合成高水平基因產(chǎn)物的手段5.進(jìn)化過程中的基因擴(kuò)增體內(nèi)擴(kuò)增PCR(polymerasechainreaction)技術(shù)在1983年，美國(guó)Cetus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明。PCR是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，又稱之為體外擴(kuò)增法。一、PCR技術(shù)原理KaryB.Mullis

Khorana(1971)等提出在體外經(jīng)DNA變性,與適當(dāng)引物雜交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的設(shè)想。

1983年,Mullis發(fā)明了PCR技術(shù),使Khorana的設(shè)想得到實(shí)現(xiàn)。

1988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)

1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)發(fā)明之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。（1）作為模板的DNA序列；（2）引物（20個(gè)左右堿基的短DNA單鏈），與被分離的目的基因兩條鏈各自5’端序列相互補(bǔ)；（3）TaqDNA聚合酶；（4）dNTP（dATP,dTTP,dGTP和dCTP）。PCR技術(shù)就是在體外中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增（包括分離）一段目的基因的技術(shù)。需要加入4種物質(zhì)：變性、退火、延伸三步曲變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對(duì)和結(jié)合延伸：以目的基因?yàn)槟０澹铣苫パa(bǔ)的新DNA鏈溫度（℃）時(shí)間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的每一個(gè)溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個(gè)步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實(shí)驗(yàn)需求為止。PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期TypicalPCRThermalProfile*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompre