基因工程講稿-1

基因工程GeneticEngineeringorGeneEngineering林擁軍聯(lián)系電話：87281719e-mail:yongjunlin@參考書1、基因工程原理；吳乃虎；科學出版社；20012、植物基因工程操作原理；王關林等；科學出版社；20003、基因工程；孫明；科學出版社；20064、AnIntroductiontoGeneticEngineering;D.S.T.Nicoll;CambridgeUniPress;20025、PrinciplesofGeneManipulation(6thedition);S.Primrose,R.Twyman,B.Old;BlackwellPublishing;2001主要的背景課《基因操作原理》《分子克隆》《分子生物學》《細胞工程》《遺傳學》緒論一、基因工程概念二、基因工程研究內(nèi)容三、基因工程的應用和發(fā)展一.基因工程概念在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構成遺傳物質(zhì)的新組合，并使之參入到原先沒有這類分子的宿主細胞內(nèi)，而能持續(xù)穩(wěn)定的傳替和表達。（吳乃虎2001）“Geneengineeringincludesarangeoftechniquesandmethodsusedbyscientiststocontrolormodifygenes,switchthemofformovethembetweentwounrelatedspecies.”一般意義上的基因工程是指“重組DNA技術”或“基因轉(zhuǎn)移技術”，即：重組DNA篩選分離外源基因載體重組轉(zhuǎn)化子整合基因工程圖解：轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染受體細胞基因工程的四要素1、目的基因2、載體3、轉(zhuǎn)化方法4、受體expressedsequenceregulatorysequencessuitablecodonusageforthehostortargetorganismprokaryoteveukaryotepost-transcriptionalissuescelllinevgermlinetransformation

Theterms'genetechnology',‘geneticmanipulation’,'geneticengineering'and'geneticmodification'meanthesamething,andrefertoonetypeofmodernbiotechnology.二.基因工程的研究內(nèi)容1、基因的分離、克隆2、載體的選擇及其構建3、基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立4、基因轉(zhuǎn)化技術5、轉(zhuǎn)化體的篩選6、外源基因整合和表達的檢測7、外源基因在細胞中的表達調(diào)控8、外源基因的遺傳9、基因工程的安全性三.基因工程的應用與發(fā)展1.基因工程的建立（1）理論基礎：a、DNA是遺傳信息的攜帶者（40s）；b、DNA能自我復制和傳替（50s）；c、“中心法則”的提出和遺傳密碼子的通用性。目標基因的獲得方法？基因工程的工具酶？載體？目的基因?qū)胧荏w的方法？

由于這些問題的解決，人們期待的應用類似工程技術的程序，主動地改造生物的遺傳特性，創(chuàng)造具有優(yōu)良性狀的生物新類型的美好愿望，從理論上講已有可能變?yōu)楝F(xiàn)實。（2）技術基礎：a、工具酶：限制性內(nèi)切酶（1972年）、連接酶（1967年）。（核心技術）b、質(zhì)粒載體c、受體的轉(zhuǎn)化方法（3）基因工程的建立?1972年，美國斯坦福大學的Berg等率先完成了世界上第一次DNA重組試驗。T4-DNALigaseSV40-DNA酶切片段+-DNA酶切片段重組體?1973年，斯坦福大學的Cohen等人進行的體外DNA重組試驗。EcoRI重組DNA分子大腸桿菌轉(zhuǎn)化獲得能在卡那霉素和四環(huán)素雙重抗生素上生長的轉(zhuǎn)化子R6-5DNA（Kan+）+pSC101DNA（Tet+）?Cohen和Boyer合作，應用與上述類似的方法，把非洲爪蟾的編碼核糖體基因的DNA片段，同pSC101質(zhì)粒重組，并導入大腸桿菌細胞。轉(zhuǎn)化子的分析結果表明，動物基因的確進入大腸桿菌細胞，并轉(zhuǎn)錄出相應的mRNA產(chǎn)物。至此，基因工程建立2、基因工程的應用與發(fā)展

基因工程自70年代初問世以來，經(jīng)過三十多年的發(fā)展，無論是在基礎研究領域，還是在生產(chǎn)實際應用方面，都取得了驚人的成績。它不僅使整個生命科學研究發(fā)生了前所未有的深刻變化，而且也給工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟發(fā)展帶來了巨大的效益。我們已經(jīng)很難說清究竟還有哪個生物科學領域沒有受到它的直接或間接影響。Micro-organismsasfactoriesE.coliandyeastmakegoodfactoriesrapidgrowthsimple,cheapgrowthmediaandconditionsrelativelysimpletotransformandselectE.colifactoriescanmake:pigmentsantibioticsPharmaceuticals藥品industrialenzymespesticidesinsulintetracyclinrennetHepatitisvaccinebialaphosBiopharmingwithtransgenicgoatsfoetalfibroblastcellsfroma30dayoldfoetuswereharvestedmicroinjectionwithahumangeneforATIIIreimplantationofthesinglecellsintothegoatuterusATIIIhasamarketasananticoagulantforpatientsundergoingcardiacsurgeryworldmarketofUS$200millioncanbesuppliedbylessthan100femalegoatsPicturefrommediareleaseMay,1999Transgenictripletsproducemilkwithbloodanticoagulantprotein（抗凝蛋白）ATIIIATIIIisfoundinnormalplasmaandregulatesbloodclottingPigwastemanagementPinanimalwasteisamajorenvironmentalconcernmostorganicPfromplantfoods(grains)isintheformofphytate（肌醇六磷酸）(myo-inositolhexakisdihydrogenphosphate)pigsandpoultryarethemajorculprits,astheylackthephytaseenzyme,hencearepoordigestersofphytatehence,theyrequire:supplementationwithinorganicPorphytaseinfeedameansofdealingwithexcessivePinpiggerywasteoreutrophication（富營養(yǎng)化）

occursGMpigsfromCanadagetphytaseexpressedinpigsalivaryglands（唾液腺）2components:Parotid（腮腺）

secretoryproteinpromoterE.coliappAphytasegeneMicroinjectionof4,147embryosproduced33transgenicpiglets14pigletsproduced>5U/mlphytaseinsalivafromprogenies,1linewasprocuredwhichproduced2,420U/mlphytasethesepigswerefedonsoybeanandnoPsupplementOutcome:allphytatewasdigested75%reductioninPinfaecalwasteGolovanetal,(2001)NatureBiotechnology,19:741-745CohoSalmon(Devlinetal.1994)Growthhormoneexpressedincoldwaters,unlinkedfromtemperaturecue.Novelgeneconstruct:strongpromoter(sockeyeMT)+extragrowthhormonegene(sockeyeGH).Mudloach(Nametal.2001)

-actinpromoterlinkedtoGHgene.Growthincrease>30fold.Gigantism.Age=6months已獲成功的轉(zhuǎn)基因植物植物至少35科200種性狀抗蟲、抗病（病毒、細菌和真菌性病害）抗除草劑抗逆境（抗旱、抗?jié)n、抗高溫冷害等）品質(zhì)改良、生長發(fā)育調(diào)控、產(chǎn)量潛力ATTRIBUTES1Herbicidetoleranceallowsgrowerstoutilizelowercostherbicidesthataregentlerontheenvironment.Cropsaregeneticallyimprovedtotoleratecertainherbicidessothatweedsarecontrolledandthecropthrives.HerbicideTolerantPestResistantInsectsdestroyover$1billionincropseachyear.Btcropsproduceaproteinthateliminatestargetedpests.Btnaturallydestroytheirowninsectpredators.2ATTRIBUTESCropdiseasesreducesyieldandquality.Biotechtransfersnewdiseasefightinggeneintocropplants.Cropsaregeneticallyenhancedtonaturallyresistdisease.DiseaseResistant3ATTRIBUTESIncreasingYields

Stress-tolerance

4BENEFITSbiotechnologyIncreasedavailabilityoffruits&vegetablesLowersaturatedfatHigherlevelsofvitaminsEdiblevaccines5Health&NutritionBENEFITSbiotechnologyRoundUpReadycrops

EPSP合成酶

莽草酸

5-磷酸莽草酸

5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸

分枝酸

鄰-氨基苯甲酸預苯酸

色氨酸

酪氨酸

苯丙氨酸

草甘膦抑制EPSP合成酶活性

結果：莽草酸途徑被抑制，造成植物芳香族氨基酸的缺乏獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物的方法:EPSP合成酶的過量表達

對除草劑不敏感的EPSP合成酶

除草劑的解毒基因Btcrops

Bacillusthuringiensis(Bt)toxinisaninsecticidalproteininthenaturalstate,theprotoxiniscleavedintheinsectmidgutby:proteaseactivityalkalinepHBttoxinshavebeenusedasbiopesticidessincethe1960sBtcropsarenowbeinggrowninternationally:

cottonmaizepotatoFattyacidbiosynthesisGeneralisedpathwaysaturatedfat monunsaturatedfat polyunsaturatedfat

Δ18desaturase Δ12desaturaseexamplesstearicacid oleicacid linoleicacidincreasemonounsaturatedoilsGoldenricevitaminA=retinol-producedbyanimalsinliver,milkandeggsplantsdonotproducevitA-butsomeproduce?-carotene,aprecursorforvitAincluding“yellowvegetables”,yellowendospermcornandsorghuminmanydevelopingcountries,vitAdeficiencyisamajorproblem:眼球干燥癥–失明免疫功能下降\\\\Goldenrice-endospermspecificexpressionofa3-steppathwayBasicsubstrate-牻牛兒基牻牛兒基二磷酸(GGPP)GGPP+GGPPphytoenelycopene?-carotene(provitaminA)phytoenesynthase(1)phytoenedesaturase(2)lycopenebeta-cyclase(3)Sourceofgenesencodingenzymes:(1)+(2)fromdaffodil（水仙）Narcissuspseudonarcissus(3)frombacteriumErwiniauredovora（八氫番茄紅素）（番茄紅素）ImprovingthenutritionalvalueofGoldenRicethroughincreasedpro-vitaminAcontentPaineetal.Nat.Biotechnol.

23,482-487(2005)apsyfrommaizesubstantiallyincreasedcarotenoidaccumulationanincreaseintotalcarotenoidsofupto23-fold(maximum37μg/g)comparedtotheoriginalGoldenRiceVaccinesfromplants?ORWhichformofvaccinewouldyouratherhave?Whichformwouldyourathergivetoachild?Transgenicplantshavebeenshowntoproducevaccines,suchasoneforHepatitisB,whichisdemonstrablyeffectiveinmicedemonstratedintobacco,potatoproblem-mustbeextractedorislostinprocessingfreshfruitorvegetableistheonlypossiblemechanismofdeliverybananapapayaappletomatoMedicinalhoneyfromGMplantsnectarfromGMcropsbeusedtoproducehoneycontainingdrugs/vaccinescasestudyfromUniversityofWageningen:GMpetuniaswithaparvovirusvaccinetofeedtodogsevidenceshowsthatthesugarsinhoneymayalsoprotecttheprotein(vaccine)whichwouldotherwiserequirerefrigerationthinkoftheadvantagesintropicalcountries!第一章目的基因的克隆策略一、基因克隆的目的與意義

Isolationofageneenablesthedeterminationofitsnucleotidesequence.Fromthisinformationtheinternallandmarksofthegenecanbedetermined–forexample,intronnumberandposition;promoterelements.

AcomparisonofDNAsequencesbetweengenescanleadtoinsightsingeneevolution.ConvertingtheDNAsequenceofageneintoaminoacidsequencebyusingthegeneticcodeleadstoadeterminationofthestructureoftheproteinproductofthegene,andfromthisknowledge,thefunctionofthegenecanbeinferred.

Agenecanbemovedfromoneorganismtoanother.Anorganismcontaininga"foreign"geneviageneticengineeringprocessiscalledtransgenic.Transgenicorganismscanbeusedeitherforlaboratoryresearchtoadvanceourunderstandingofbiologicalprocessesorforspecializedindustrialapplications–forexamples:DevelopmentofinsectresistantcropsProductionofhumaninsulinintransgenicbacteriacarryingappropriatehumangene二、圖位克隆法（Map-basedcloning）?

90年代初發(fā)展起來的基因克隆技術。目前，絕大多數(shù)分離克隆的基因都是通過這種方法獲得的。?

圖位克隆法是基于基因在遺傳圖譜上的位置而分離克隆基因的方法。?

圖位克隆法包括以下步驟：(a)Targetgenemapping:ahighresolutiongeneticmapwithaveragedistanceislessthan2cM.(b)Physicalmapping:amapofthelocationsofidentifiablelandmarksonDNA,regardlessofinheritance.Distanceismeasuredinbasepairsotherthangeneticrecombination(incM).MethodsforphysicalmappinginvolveFISH,YACs,BACs,STSs(sequencetaggedsites).(c)

Chromosomewalkingorlanding:--ChromosomewalkingreliesonisolationofaDNAfragmentatornearanendofaclonedinsertforuseasaprobetoscreenthelibraryandidentifymoreclones.--Chromosomallanding:Startwithidentifyingtightlylinkedmolecularmarkers.TheDNAmarkersarethenusedtoscreenalibraryandisolate(orlandon)theclonecontainingthegene.(d)Geneidentification:Geneticcomplementationthroughtransformation.舉例：基因的克隆構建作圖群體（F2、RIL、DH或NIL）分子標記作區(qū)段高密度遺傳連鎖圖Chr基因Xigfhedcba1.8cM3.5cM0.5cM1.2cM0.8cM以距基因最近的兩側分子標記篩選文庫（BAC,PACorYAC文庫），分離片段末端進行染色體步查（chromosomewalking)walkinglandinggef1.8cM0.5cMXgene文庫片段測序Genscan和Blast，候選基因確定轉(zhuǎn)基因功能驗證三、mRNA

差異顯示法(未知序列基因克?。﹎RNAdifferentialdisplay3’錨定引物5’隨機引物放射性標記?ReamplifyandconfirmbyNorthernblot?Cloneandsequence?Conductfurtherstudies:Cutoutdifferentiallyexpressedbandsand:?Generatefull-lengthcDNAs?Obtaingenomicclonesorregulatorysequences該方法的優(yōu)缺點：優(yōu)點：

（1）可以同時比較多個樣品間基因表達差異；（2）可以同時檢測到“上游”及“下游”基因；（3）檢測靈敏度高，所需樣品少，一些低豐度mRNA也能被檢測出來；

缺點：（1）假陽性的比例甚高，假陽性率高達50~70%；（2）擴增的差別條帶的分子長度比較短，大多在110-450bp之間。

※扣除雜交是比較兩個群體的mRNA表達差異，從而克隆僅在其中一個群體中表達的基因的有力的方法。

原理：首先，把兩個群體分離的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；我們把含有特異基因表達的群體的cDNA做“tester”，參照群體的cDNAs為driver；然后在driver過量的情況下將兩者進行雜交，除去雜交的序列；結果，那些未雜交的cDNAs即是tester中特異表達的mRNA.四、基因組扣除雜交法(未知序列基因克?。╣enomicsubtractionhybridization)

※特別實用于分離在特定組織中表達的基因，在細胞周期特定階段表達的基因，受生長因子調(diào)節(jié)的基因，以及在特定發(fā)育階段表達的或者是參與發(fā)育調(diào)節(jié)的基因。同時亦可有效分離經(jīng)特殊處理而誘導表達的基因。工作流程：cDNAsynthesisTesteranddriverdscDNAarepreparedfromthetwomRNAsamplesundercomparison.RsaIdigestionTesteranddrivercDNAareseparatelydigestedtoobtainshorter,blunt-endedmolecules.AdaptorligationTwotesterpopulationsarecreatedwithdifferentadaptors,butdrivercDNAhasnoadaptors.FirsthybridizationHybridizationkineticsleadtoequalizationa