《臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)》 診斷酶學(xué)

第五章診斷酶學(xué)衛(wèi)生部“十二五”規(guī)劃教材全國(guó)高等醫(yī)藥教材建設(shè)研究會(huì)規(guī)劃教材首都醫(yī)科大學(xué)王培昌教學(xué)內(nèi)容一、酶的概念與特征（一）酶的組成、結(jié)構(gòu)與功能1.酶的本質(zhì)和特征2.酶的結(jié)構(gòu)和功能（二）酶的催化作用機(jī)制1.酶活性中心是酶分子執(zhí)行催化功能部位2.酶反應(yīng)的誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)（三）酶的命名1.習(xí)慣命名法2.系統(tǒng)命名法（四）酶的分類(lèi)與編號(hào)

第一節(jié)概述（一）酶的組成、結(jié)構(gòu)與功能1.酶的本質(zhì)和特征⑴酶的化學(xué)本質(zhì)：絕大部分的酶是蛋白質(zhì)，有些酶是核酸和酶蛋白組成的復(fù)合體，極少數(shù)酶是核酸。⑵酶除了具有蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、一般催化劑的共同性質(zhì)外，還具有極高的催化效率、高度的特異性（specificity）及催化作用的可調(diào)節(jié)性等特點(diǎn)。

⑶由酶所催化的反應(yīng)稱(chēng)為酶促反應(yīng)。

酶促反應(yīng)過(guò)程中的幾個(gè)概念：

酶活性（activity）；底物（substrate）；

產(chǎn)物（product）；

激活劑（activator）；抑制劑（inhibitor）⑷核酶（ribozyme）：具有催化作用的核糖核酸。2.酶的結(jié)構(gòu)和功能⑴酶和一般蛋白質(zhì)一樣，具有一、二、三乃至四級(jí)結(jié)構(gòu)。

單體酶（monomericenzyme）寡聚酶（oligomericenzyme）多酶體系（multienzyme）多功能酶或串聯(lián)酶（tandemenzyme）⑵單純酶（simpleenzyme）：僅由氨基酸殘基構(gòu)成的酶。

結(jié)合酶（conjugatedenzyme）：除含蛋白質(zhì)外，還含有非蛋白部分（金屬離子或小分子有機(jī)化合物），前者稱(chēng)為酶蛋白，后者稱(chēng)為輔因子。（二）酶的催化作用機(jī)制1.酶活性中心是酶分子執(zhí)行催化功能部位酶分子中能和底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域稱(chēng)為酶的活性中心（activecenter），酶活性中心是由空間上彼此靠近的化學(xué)基團(tuán)組成的具有特定空間結(jié)構(gòu)的區(qū)域。2.酶反應(yīng)的誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)（inducedfithypothesis）在酶促反應(yīng)中，酶與底物結(jié)合時(shí)，底物首先和酶分子上的活性中心相結(jié)合，形成酶-底物中間復(fù)合物（ES）。在構(gòu)象上相互誘導(dǎo)，致使活性中心與底物完全緊密結(jié)合，這一過(guò)程稱(chēng)為誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)。（三）酶的命名1.習(xí)慣命名法根據(jù)酶所催化的底物、反應(yīng)的性質(zhì)以及酶的來(lái)源等進(jìn)行命名。此法雖較簡(jiǎn)單，但缺乏系統(tǒng)性，易造成混亂。2.系統(tǒng)命名法國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)于1961年提出了酶的系統(tǒng)命名法（又稱(chēng)EC命名法）。規(guī)定每一酶均有一個(gè)系統(tǒng)名稱(chēng)，它標(biāo)明酶的底物與反應(yīng)性質(zhì)，底物名稱(chēng)之間以“︰”分隔開(kāi)。（四）酶的分類(lèi)與編號(hào)1.

根據(jù)酶所催化反應(yīng)類(lèi)型可將酶分為六大類(lèi)，即：

氧化還原酶類(lèi)（oxidoreductases）

轉(zhuǎn)移酶類(lèi)（transferases）

水解酶類(lèi)（hydrolases）

裂解酶類(lèi)（或裂合酶類(lèi)）（lyases）

異構(gòu)酶類(lèi)（isomerases）合成酶類(lèi)〔synthetases或連接酶類(lèi)(ligases）〕2.國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)將每種酶用4個(gè)數(shù)字加以系統(tǒng)編號(hào)。數(shù)字前冠以EC，數(shù)字之間用黑點(diǎn)隔開(kāi)。第一個(gè)數(shù)字表示酶的類(lèi)別，第二個(gè)表示亞類(lèi)，第三個(gè)表示亞-亞類(lèi)，第四個(gè)表示酶的編號(hào)序數(shù)。二、同工酶的概念與特征(一)同工酶的概念與特征

同工酶是指催化相同化學(xué)反應(yīng)，但酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。

同工酶存在于同一種屬或同一個(gè)體的不同組織或同一細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，使不同的組織、器官和不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有不同的代謝特征，這為同工酶用來(lái)診斷不同器官的疾病提供了理論依據(jù)。(二)同工酶分類(lèi)與命名分類(lèi)根據(jù)同工酶的來(lái)源和結(jié)構(gòu)不同，從基因角度可將其分為：?jiǎn)位驔Q定的同工酶、復(fù)等位基因同工酶、多基因決定的同工酶和修飾的同工酶等四類(lèi)。命名至今尚無(wú)確切的方法，常以組織名稱(chēng)、亞基的數(shù)目和組成或發(fā)現(xiàn)地地名等命名。酶同工酶種類(lèi)相關(guān)疾病CKCK-BB,CK-MB,CK-MM(CK1,CK2,CK3)心梗、肌病、顱腦損傷、腫瘤LDLD1,LD2,LD3,LD4,LD5心梗、肌病、肺梗死、肝病、腫瘤ALP肝，小腸，骨，胎盤(pán)，腎肝膽疾病、骨病、妊娠、結(jié)腸炎、腫瘤ACP紅細(xì)胞，前列腺，溶酶體前列腺癌、血液病、骨腫瘤γ-GTγ-GT1,γ-GT2,γ-GT3,γ-GT4肝癌、梗阻性黃疸AMYP-AMY(P1,P2,P3),S-AMY(S1,S2,S3,S4)急、慢性胰腺炎、腮腺炎ALTALTs,ALTm心梗、肝病ASTASTs,ASTm心梗、肝病GPGP-BB,GP-LL,GP-MM(GP1,GP2,GP3)心梗、腦損傷、腎病、肌病GSTGST1和GST2(GST-α),GST3(GST-μ),GST4和GST5(GST-π)肺癌、肝炎ALDALD-A,ALD-B,ALD-C肝癌、肝炎、神經(jīng)細(xì)胞癌NAGNAG-A,NAG-B,NAG-I肝病、腎病人體中幾種重要的同工酶三、工具酶（一）工具酶參與的指示反應(yīng)（二）

酶循環(huán)法（三）代謝物濃度的酶法測(cè)定技術(shù)

1.終點(diǎn)法（1）直接法（2）酶偶聯(lián)法2.動(dòng)力學(xué)法(一)工具酶參與的指示反應(yīng)

通常把酶學(xué)分析中作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性濃度的酶稱(chēng)為工具酶。常用工具酶多為氧化還原酶類(lèi)。

在臨床生化檢驗(yàn)中，許多項(xiàng)目的測(cè)定均有工具酶參與，最常用的有兩類(lèi)分光光度法：

一類(lèi)是利用較高特異性的氧化酶產(chǎn)生過(guò)氧化氫（H2O2），再加氧化發(fā)色劑比色；另一類(lèi)是利用氧化-還原酶反應(yīng)使其連接到NAD(P)-NAD(P)H的正/逆反應(yīng)后，直接通過(guò)分光光度法或其他方法測(cè)定NAD(P)H的變化量。(二)酶循環(huán)法

酶循環(huán)法（enzymaticcyclingmethods）采用兩類(lèi)工具酶進(jìn)行循環(huán)催化反應(yīng)，使被測(cè)物放大擴(kuò)增，從而使檢測(cè)靈敏度提高。目前臨床上已應(yīng)用于總膽汁酸的測(cè)定。

為了簡(jiǎn)化操作過(guò)程，并使酶試劑得以方便或反復(fù)使用，已有許多研究將水溶性的酶通過(guò)吸附、包埋、載體共價(jià)結(jié)合或通過(guò)酶分子間共價(jià)交聯(lián)等方法固定在支持物上，并保持其原有的活性，這樣制備的酶稱(chēng)為固相酶（或固定酶）（immobilizedenzymes）。（三）代謝物濃度的酶法測(cè)定技術(shù)1.終點(diǎn)法

在代謝物酶促反應(yīng)中，隨著時(shí)間的延續(xù)，待測(cè)物濃度逐漸減少而產(chǎn)物逐漸增多，一定時(shí)間后反應(yīng)趨于平衡，測(cè)定反應(yīng)達(dá)到平衡后待測(cè)物（底物）或產(chǎn)物變化的總量，即終點(diǎn)法（又稱(chēng)平衡法）。(1)直接法：如果待測(cè)物與產(chǎn)物在理化性質(zhì)上有可直接進(jìn)行檢測(cè)的差異，如吸收光譜不同，則可直接測(cè)定待測(cè)物或產(chǎn)物本身信號(hào)的改變來(lái)進(jìn)行定量分析.(2)酶偶聯(lián)法：如果酶促反應(yīng)的底物或產(chǎn)物無(wú)可直接檢測(cè)的成分，則可將反應(yīng)某一產(chǎn)物偶聯(lián)到另一個(gè)酶促反應(yīng)中，而達(dá)到檢測(cè)的目的，即為酶偶聯(lián)法。代謝物酶促終點(diǎn)法測(cè)定的基本條件是：①待測(cè)物濃度[S]應(yīng)遠(yuǎn)小于其米氏常數(shù)Km，此時(shí)任何時(shí)刻的反應(yīng)速率V=Vmax[S]/Km，呈一級(jí)反應(yīng)；②反應(yīng)配方中所用酶量（V）應(yīng)足夠大，而Km應(yīng)小，以保證有較快的反應(yīng)速度完成測(cè)定。※終點(diǎn)法測(cè)定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，主要應(yīng)考慮以下問(wèn)題：

（1）工具酶的特異性：（2）Km大小要合適：（3）酶的用量（4）工具酶中的雜酶應(yīng)低于允許限。（5）反應(yīng)平衡點(diǎn)：（6）附加劑：應(yīng)不抑制酶的活性2.動(dòng)力學(xué)法

根據(jù)米氏方程，當(dāng)[S]<<Km，一般[S]/Km<0.2，最好<0.05，[S]+Km≈Km，此時(shí)呈一級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)初速度v=k[S]。如果能準(zhǔn)確測(cè)定反應(yīng)的初速度（v），采用標(biāo)準(zhǔn)濃度對(duì)照法即可求得待測(cè)物的濃度。酶活性測(cè)定酶學(xué)測(cè)定方法酶質(zhì)量測(cè)定固定時(shí)間法（

fixedtimeassay

）連續(xù)監(jiān)測(cè)法（continuousmonitoringassay）

第二節(jié)酶測(cè)定技術(shù)一、酶活性測(cè)定（一）定時(shí)法測(cè)定酶活性（二）連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性（三）干擾因素（四）血清酶活性濃度測(cè)定的條件的優(yōu)化（五）部分分析前因素對(duì)酶活性測(cè)定的干擾

（六）酶活性濃度的單位（七）系數(shù)K值的計(jì)算與應(yīng)用（八）臨床酶學(xué)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化(一)定時(shí)法測(cè)定酶活性

定時(shí)法是根據(jù)固定時(shí)間內(nèi)底物消耗量或產(chǎn)物的生成量計(jì)算酶活性，這是早期測(cè)定酶活性濃度的方法。用定時(shí)法準(zhǔn)確測(cè)定酶活性濃度，必須了解不同酶促反應(yīng)速率和時(shí)間的關(guān)系，應(yīng)先做預(yù)試驗(yàn)找出酶促反應(yīng)速率恒定的時(shí)期，確定線性時(shí)間，然后在這段時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，避開(kāi)延滯期和一級(jí)反應(yīng)。

定時(shí)法中可能引起的誤差(二)連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性

連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間變化的多點(diǎn)數(shù)據(jù)，求出酶反應(yīng)初速度，間接計(jì)算酶活性濃度的方法稱(chēng)為連續(xù)監(jiān)測(cè)法。1.直接法在不終止酶促反應(yīng)條件下，直接通過(guò)測(cè)定反應(yīng)體系中底物或產(chǎn)物理化特性的變化如吸光度、熒光、旋光性、pH、電導(dǎo)率、粘度等計(jì)算出酶活性濃度。

只有底物與產(chǎn)物之間，在理化性質(zhì)等方面有顯著差異時(shí)，才能使用直接法。2.間接法

采用酶偶聯(lián)反應(yīng)是間接法測(cè)定酶活性的主要技術(shù)特點(diǎn)。(1)最簡(jiǎn)單的酶偶聯(lián)反應(yīng)（單底物反應(yīng)且只有一個(gè)工具酶）模式為：

Ex：被測(cè)定酶C：被檢測(cè)物質(zhì)Ei：指示酶

Ex催化的反應(yīng)稱(chēng)為始發(fā)反應(yīng)，產(chǎn)生被檢測(cè)物質(zhì)產(chǎn)物C的反應(yīng)稱(chēng)為指示反應(yīng)。(2)如果一些酶促反應(yīng)找不到合適的指示酶與其直接偶聯(lián)，此時(shí)往往還可在始發(fā)反應(yīng)和指示反應(yīng)之間加入另一種酶，將二者連接起來(lái)，此反應(yīng)稱(chēng)為輔助反應(yīng)。模式為：一般習(xí)慣將最后一個(gè)酶稱(chēng)指示酶Ei，其他外加的酶稱(chēng)為輔助酶（Ea）。(3)偶聯(lián)反應(yīng)中存在幾個(gè)時(shí)相：①預(yù)孵育期：反應(yīng)一開(kāi)始只存在底物A，不存在指示酶的反應(yīng)。②延滯期：加入底物啟動(dòng)反應(yīng)，在啟動(dòng)后的一段短時(shí)間內(nèi)，產(chǎn)物B開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增加，但仍處于較低水平，指示酶反應(yīng)速度也較低，不能代表測(cè)定酶的反應(yīng)速率Vx。③穩(wěn)態(tài)期：產(chǎn)物B增加到一定程度時(shí)，Ex和Ei催化的反應(yīng)速率相同，達(dá)到了穩(wěn)態(tài)期。此階段特定波長(zhǎng)處（如340nm）吸光度才會(huì)有明顯的線性變化。

酶偶聯(lián)法測(cè)定ALT的吸光度變化(4)指示酶的選擇①Vx/(Km)x=Vi/(Km)iVi：指示酶的用量

Vx：測(cè)定酶的測(cè)定上限

(Km)x：分別是測(cè)定酶(Km)i：指示酶的米氏常數(shù)②米-曼氏方程在酶偶聯(lián)反應(yīng)中，指示酶催化反應(yīng)速率Vi的計(jì)算公式為：

式中Vx為測(cè)定酶的測(cè)定上限，(Km)i為指示酶的米氏常數(shù)，P為中間產(chǎn)物濃度。③McClure介紹的另一種近似計(jì)算法計(jì)算延滯期時(shí)所需指示酶的量。

假定酶偶聯(lián)反應(yīng)如下：

第一個(gè)反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)，第二個(gè)反應(yīng)為一級(jí)反應(yīng)。如測(cè)定時(shí)間很短，[C]濃度不高時(shí)，指示酶催化反應(yīng)速率Vi可通過(guò)下列公式進(jìn)行計(jì)算：式中t*表示延滯時(shí)間，(Km)i為指示酶的米氏常數(shù)，F(xiàn)b是在t*時(shí)產(chǎn)物B為其穩(wěn)態(tài)濃度的百分?jǐn)?shù)，一般選用0.99。(三)干擾因素

1.其他酶和物質(zhì)的干擾2.酶的污染3.非酶反應(yīng)4.分析容器的污染5.沉淀形成(四)血清酶活性濃度測(cè)定的條件的優(yōu)化

測(cè)定酶活性濃度方法所選擇的測(cè)定條件應(yīng)是酶促反應(yīng)的“最適條件”，即指在所選擇溫度下能使酶促反應(yīng)的催化活性達(dá)到最大。主要與下述一些因素有關(guān)：

①如底物、輔因子、活化劑、緩沖液和變構(gòu)劑種類(lèi)和濃度；

②指示酶和輔助酶的種類(lèi)和濃度；

③反應(yīng)混合液的pH和離子強(qiáng)度；

④其他可變因素，如已知抑制劑的去除。1.方法選擇盡可能采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法；盡量減少操作步驟。2.儀器和設(shè)備明確規(guī)定儀器和設(shè)備的各種性能規(guī)范。3.試劑化學(xué)試劑必須具有一定純度；試驗(yàn)用水最好是純水或雙蒸水。4.自動(dòng)生化分析儀參數(shù)的設(shè)置（1）方法類(lèi)型終點(diǎn)法或連續(xù)監(jiān)測(cè)法。反應(yīng)方向分正向/向上/+（吸光度增加）或負(fù)向/向下/-（吸光度減低）。（2）波長(zhǎng)選擇酶促反應(yīng)體系吸光度最大的波長(zhǎng)（3）樣品量與試劑量應(yīng)考慮測(cè)定的靈敏度和測(cè)定上限選用合適的樣品與試劑體積比。一般推薦樣品與試劑體積比為1:10。（4）稀釋水量（5）反應(yīng)時(shí)間線性反應(yīng)時(shí)間范圍愈寬者，愈適于臨床應(yīng)用。（6）孵育時(shí)間（7）延遲時(shí)間（8）監(jiān)測(cè)時(shí)間酶活性測(cè)定的連續(xù)監(jiān)測(cè)法至少90~120s或至少4點(diǎn)（3個(gè)

A），少于3個(gè)

A不能稱(chēng)為連續(xù)監(jiān)測(cè)法，因?yàn)椴荒苡?jì)算線性度（不知是否為線性反應(yīng)）。（9）試劑吸光度上、下限（10）底物耗盡限額（11）線性度（12）試劑空白速率（13）線性范圍按試劑質(zhì)量而設(shè)置，超過(guò)范圍應(yīng)增加樣品量或稀釋后重測(cè)。（14）計(jì)算因子F值（或系數(shù)K）(五)部分分析前因素對(duì)酶活性測(cè)定的干擾1.溶血部分酶在紅細(xì)胞膜或紅細(xì)胞內(nèi)的濃度遠(yuǎn)高于細(xì)胞外（如乳酸脫氫酶、蘋(píng)果酸脫氫酶、己糖激酶等），少量血細(xì)胞的破壞就可能引起血清中酶明顯升高。2.抗凝劑

草酸鹽、檸檬酸鹽和EDTA等抗凝劑為金屬螯合劑，可抑制需Ca2+的AMY，也可抑制需Mg2+的CK和5’-NT；

草酸鹽既可與丙酮酸或乳酸發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，又能與LD及NADH或NAD+形成復(fù)合物，從而抑制催化的還原或氧化反應(yīng)。

檸檬酸鹽、草酸鹽對(duì)CP、ChE均有抑制作用。3.標(biāo)本儲(chǔ)存溫度大部分酶在低溫中可穩(wěn)定較長(zhǎng)時(shí)間，標(biāo)本如在離體后不能及時(shí)測(cè)定，應(yīng)及時(shí)分離血清或血漿并置冰箱冷藏。酶室溫（25℃）

冷藏（0~4℃）冰凍（-25℃）LD1周1~3d§1~3d§

-GT2d1周1月ALD2d2d不穩(wěn)定*ALT2d5d不穩(wěn)定*AST3d1周1月CK1周1周1月ChE1周1周1周ALP2~3d2~3d1月ACP4h※3d#3d#-NT24h1周3月AMY1月7月2月LPS1周3周3周LAP1周1周1周不同貯存溫度時(shí)體液酶的穩(wěn)定性（活性變化小于10%）*酶不耐融化；§與同工酶類(lèi)型有關(guān)；※標(biāo)本未酸化；#標(biāo)本加枸櫞酸或醋酸至pH5

(六)酶活性濃度的單位1.酶活性單位（1）慣用單位（2）國(guó)際單位（3）Katal單位1979年國(guó)際生化協(xié)會(huì)為了使酶活性單位與國(guó)際單位制（SI）的反應(yīng)速率相一致，推薦用Katal單位（也稱(chēng)催量，可簡(jiǎn)寫(xiě)為Kat）。即在規(guī)定條件下，每s時(shí)間內(nèi)催化轉(zhuǎn)化1摩爾底物的酶量，1katal=1mol·s-1。

我國(guó)法定計(jì)量單位制中的酶催化活性單位為katal，其對(duì)血清中酶量而言顯然過(guò)大，故常用單位為μkatal或nkatal。1katal=60×106U，1U=1μmol·min-1=16.67nmol·s-1=16.67nkatal。2.酶活性濃度單位臨床上測(cè)定的不是酶的絕對(duì)量而是濃度。酶活性濃度以每單位體積所含的酶活性單位數(shù)表示。（1）表示方法目前在臨床化學(xué)中，各國(guó)學(xué)者幾乎都習(xí)慣用U/L來(lái)表示體液中酶催化濃度。1U/L=16.67nkatal/L。（2）酶活性濃度單位的計(jì)算用連續(xù)監(jiān)測(cè)法進(jìn)行酶活性測(cè)定時(shí)，不需作標(biāo)準(zhǔn)管或標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)摩爾吸光系數(shù)很容易進(jìn)行酶活性濃度的計(jì)算。摩爾吸光系數(shù)（ε）的定義為：在特定條件下，一定波長(zhǎng)的光，光徑為1.00cm時(shí)，通過(guò)所含吸光物質(zhì)的濃度為1.00mol/L時(shí)的吸光度。

如用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定在線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的變化（

A/min），以U/L表示酶活性濃度時(shí)，則可按下式進(jìn)行計(jì)算：式中：V—反應(yīng)體系體積（ml）

ε—摩爾吸光系數(shù)（cm2·mol-1）v—樣品量（ml）

L—比色杯光徑（cm）△A—吸光度變化

106—將mol換算成μmol3.參考區(qū)間和正常上限倍數(shù)的應(yīng)用（1）參考區(qū)間

由于臨床實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行酶學(xué)測(cè)定時(shí)所選儀器、試劑和方法不同，加之生物學(xué)變異等對(duì)酶活性影響，常常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室之間所得參考區(qū)間差別甚遠(yuǎn)，應(yīng)根據(jù)各自情況對(duì)各種酶建立自己的參考區(qū)間。表5-4列舉了幾種臨床常用酶的成人參考區(qū)間。（2）正常上限倍數(shù)的應(yīng)用

正常上限倍數(shù)是指把酶測(cè)定值轉(zhuǎn)換為正常上限值的倍數(shù)。在分析酶學(xué)報(bào)告時(shí)，除傳統(tǒng)測(cè)定的報(bào)告方式（U/L）外，也提倡用正常上限（upperlimitsofnormal,ULN）倍數(shù)作為酶活性濃度的表示法。臨床常用血清酶的測(cè)定方法與參考區(qū)間（37℃）

*國(guó)際臨床化學(xué)聯(lián)合會(huì)（IFCC）參考方法；

#實(shí)際為擬膽堿酯酶（PChE）酶方法參考區(qū)間ALT連續(xù)監(jiān)測(cè)法底物中含磷酸吡哆醛

底物中不含磷酸吡哆醛男：≤45U/L；女：≤34U/L*5~40U/LAST連續(xù)監(jiān)測(cè)法底物中含磷酸吡哆醛

底物中不含磷酸吡哆醛男：≤35U/L；女：≤33U/L*8~40U/LALP連續(xù)監(jiān)測(cè)法（磷酸對(duì)硝基苯酚法）1~12歲＜500U/L；男：12~15歲＜750U/L，

＞25歲40~150U/L；女：＞15歲40~150U/LACP比色法（磷酸麝香草酚法）0.5~1.9U/LLD連續(xù)監(jiān)測(cè)法

L→P，即LD-L法

P→L，即LD-P法≤252U/L*200~380U/LCK連續(xù)監(jiān)測(cè)法（酶偶聯(lián)法）男：≤169U/L；女：≤143U/L*γ-GT連續(xù)監(jiān)測(cè)法（L-γ-谷氨酰-3-羧基-對(duì)硝基苯胺法）連續(xù)監(jiān)測(cè)法（L-γ-谷氨酰-對(duì)硝基苯胺法）男：≤55U/L；女：≤38U/L*男：≤50U/L；女：≤30U/LAMY連續(xù)監(jiān)測(cè)法[對(duì)-硝基苯麥芽庚糖苷（4NP-G7）法]≤220U/LLPS固定時(shí)間法（乳化液比濁法）≤110U/LChE#連續(xù)監(jiān)測(cè)法（丁酰硫代膽堿法）5000~12000U/L(七)系數(shù)K值的計(jì)算與應(yīng)用在實(shí)際工作中，特別是用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定同一酶，條件固定時(shí)，從理論上來(lái)講V、v和L均為固定值，ε為常數(shù)，則將上述公式可簡(jiǎn)化為：

K為酶活性濃度定量系數(shù)（或稱(chēng)為常數(shù)），主要用于臨床酶活性測(cè)定的計(jì)算與校準(zhǔn)。1.系數(shù)K值的意義與設(shè)置

系數(shù)K值對(duì)于酶的測(cè)定十分重要，過(guò)高雖然測(cè)定的線性較寬，但重復(fù)性差，反之，雖然精密度好，但檢測(cè)線性窄。

K值的設(shè)置應(yīng)考慮測(cè)定酶的參考范圍上限及測(cè)定時(shí)間兩方面，以保證測(cè)定結(jié)果的可靠。2.系數(shù)K值的類(lèi)型與計(jì)算

系數(shù)K值只能供用戶(hù)通過(guò)計(jì)算式及求實(shí)測(cè)K值時(shí)參考，不能直接用于酶活性濃度的計(jì)算。常用指示物的摩爾消光系數(shù)（cm2·mol-1）與用途指示物主波長(zhǎng)次波長(zhǎng)用途NADHε340nm6.22×103ε380nm1.33×103測(cè)ALT、AST、LD、α-HBD等NADPHε340nm6.22×103ε380nm1.33×103測(cè)G6PD、CK對(duì)硝基苯酚ε405nm18.5×103ε476nm0.20×103測(cè)ALP對(duì)硝基苯胺ε405nm9.9×103測(cè)γ-GT5-硫代-2-硝基苯甲酸ε405nm13.6×103ε476nm2.80×103測(cè)ChE(八)臨床酶學(xué)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化1.標(biāo)準(zhǔn)化途徑通過(guò)使用推薦方法和參考方法，以及使用公認(rèn)的酶校準(zhǔn)物或酶參考物等，使酶學(xué)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化。（1）使用推薦方法和參考方法我國(guó)于1994年發(fā)表了《測(cè)定人血清（血漿）中酶催化濃度方法總則》，并于1995年、1996年相繼通過(guò)了ALT、γ-GT、CK、LD、ALP、AST6項(xiàng)推薦方法草案。衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《臨床酶活性濃度測(cè)定方法總則》（編號(hào)WS/T222-2002）也已由衛(wèi)生部批準(zhǔn)實(shí)施。（2）使用公認(rèn)的酶校準(zhǔn)物或酶參考物酶測(cè)定中最理想的校準(zhǔn)方法是用穩(wěn)定的、定值準(zhǔn)確的酶校準(zhǔn)物或酶參考物對(duì)測(cè)定全過(guò)程進(jìn)行校準(zhǔn)。2.酶活性濃度測(cè)定的參考系統(tǒng)

IFCC于1998年決定建立包括下列要素的測(cè)定酶催化濃度的參考系統(tǒng)：①參考測(cè)定方法，以現(xiàn)有的IFCC30℃的參考方法作為基礎(chǔ)，制定了一套37℃的標(biāo)準(zhǔn)操作方法（SOPs）；②參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)，選擇一組參考實(shí)驗(yàn)室（包括廠家實(shí)驗(yàn)室），為之提供必要的技術(shù)和儀器，使之在計(jì)量學(xué)高水平上按參考測(cè)定方法（SOPs）進(jìn)行測(cè)定；③參考物，參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)對(duì)現(xiàn)有的BCR參考物進(jìn)行重新認(rèn)證。建立原級(jí)參考方法制備原級(jí)參考物建立參考實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)二、酶質(zhì)量測(cè)定（一）免疫化學(xué)法測(cè)定酶質(zhì)量原理

利用酶蛋白的抗原性，制備特異性抗體，然后以免疫學(xué)方法測(cè)定酶蛋白質(zhì)量。質(zhì)量單位多以ng/ml、μg/L來(lái)表示。1.放射免疫測(cè)定（RIA）

分為直接法與間接法。

直接法是將放射性核素標(biāo)記的酶分子與相應(yīng)抗體作用產(chǎn)生沉淀，然后將沉淀分離并進(jìn)行定量測(cè)定。2.其他方法

主要有免疫抑制法、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定（CLIA）、酶免疫測(cè)定（EIA）、熒光酶免疫測(cè)定（FEIA）等。國(guó)內(nèi)曾有用免疫沉淀法（單向擴(kuò)散法）測(cè)定酶活性的報(bào)告，如超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定。

（二）酶質(zhì)量免疫化學(xué)測(cè)定法的優(yōu)缺點(diǎn)

與傳統(tǒng)的酶活性測(cè)定法相比，免疫化學(xué)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)主要有：①靈敏度高，能測(cè)定樣品中用原有其他方法不易測(cè)出的少量或痕量酶；②特異性高，幾乎不受體液中其他物質(zhì)，如酶抑制劑、激活劑等

的影響；③能用于一些不表現(xiàn)酶活性的酶蛋白，如各種酶原或去輔基酶蛋

白，或因遺傳變異而導(dǎo)致合成無(wú)活性的酶蛋白的酶測(cè)定；④特別適用于同工酶的測(cè)定。酶免疫化學(xué)測(cè)定局限性：①要制備足夠量的提純酶作為抗原和具有免疫化學(xué)性質(zhì)的抗血清常常是很困難的，且工作量較大；②測(cè)定步驟多，操作繁瑣；③測(cè)定成本高。三、同工酶檢測(cè)

臨床同工酶（或亞型）的分析大致可分為兩步，即首先精確地分離出某酶的各同工酶（或亞型）組分，然后測(cè)定酶的總活性和各同工酶（或亞型）組分的活性。常用同工酶（或亞型）的分析方法方法同工酶（或亞型）的性質(zhì)差異同工酶、亞型電泳法（區(qū)帶電泳、等電聚焦）電荷不同所有同工酶、亞型

層析法（離子交換層析、親和層析）電荷不同CK、LD、ALP免疫分析法

免疫抑制法特異性抗體反應(yīng)性不同CK、LD、ACP

免疫化學(xué)測(cè)定法

（RIA、EIA、FIA、CLIA）特異性抗體反應(yīng)性不同CK、LD、ACP、ALP、AMY動(dòng)力學(xué)分析法

底物特異性分析法底物Km、親和力不同ACP、CK、LD（α-羥丁酸）

抑制劑分析法對(duì)小分子量的抑制劑的特異性抑制不同LD（草酸）、ACP（L-酒石酸）、ALP（尿素和L-苯丙氨酸）、ChE（氟和可卡因）pH分析法最適pH不同AST

熱失活分析法熱穩(wěn)定性不同ALP（一）電泳法

同工酶氨基酸組成不同，等電點(diǎn)不同，電泳遷移率也就不同，據(jù)此可用電泳法分離鑒定。常用于分離同工酶電泳方法有醋酸纖維素薄膜電泳(CAE)、瓊脂糖凝膠電泳(AGE)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)等。

※以LD同工酶為例，H亞基含酸性氨基酸比M亞基多，在pH8.6的堿性緩沖溶液中帶負(fù)電荷較多，電泳速度比M亞基塊，電泳結(jié)束時(shí)由正極向負(fù)極依次有LD1、LD2、LD3、LD4、LD5共五條同工酶條帶。電泳結(jié)束后，可用含乳酸、NAD+、酚嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)和氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)的染色液將區(qū)帶染色，染色原理為：LD催化乳酸脫氫，脫下的氫由NAD+傳遞給PMS，再由PMS傳遞給NBT，NBT還原為紫紅色的化合物而使區(qū)帶染色。染色后洗脫支持介質(zhì)背景染料，用光密度掃描儀掃描區(qū)帶，或?qū)^(qū)帶切下洗脫比色測(cè)定。正常和幾種病理狀況時(shí)血清LD同工酶的瓊脂糖凝

膠電泳分離圖譜

用電泳法進(jìn)行同工酶分析時(shí)，如顯示的區(qū)帶數(shù)與同工酶數(shù)不一致時(shí)，要特別注意巨分子酶的存在。巨分子酶形成的原因主要有：①酶與免疫球蛋白形成的復(fù)合物，如CK-BB-IgG、CK-MM-IgA、LD-IgA等；②酶與其他蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物，如LD-β-脂蛋白等；③酶亞基或酶分子之間形成的聚合物，如CK-Mt聚合物、LD亞基自身聚合等?，F(xiàn)已有關(guān)于CK、LD、AST、AMY、γ-GT和ALP等巨分子酶的報(bào)道。如，將可疑血清進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合熒光染色掃描分析，發(fā)現(xiàn)巨CK1位于CK-MM與CK-MB之間，巨CK2位于CK-MM的陰極側(cè)（圖5-4）。正常和病理狀況時(shí)瓊脂糖凝膠電泳分析血清CK同工酶可能出現(xiàn)的酶帶（二）層析法離子交換層析和親和層析等常用于同工酶的提純與制備，也可用于臨床同工酶常規(guī)檢測(cè)。同工酶分子荷電量不同是離子交換層析法分離的基礎(chǔ)，常用的離子交換劑有二乙氨基乙基纖維素(DEAE-C)、二乙氨基乙基葡聚糖A-50(DEAE-SephadexA-50)、二乙二羥丙氨乙基葡聚糖A-50(QAE-SephadexA-50)等