《生物化學(xué)簡明教程》第四版 第二章蛋白質(zhì)

第2章

蛋白質(zhì)(Protein)

蛋白質(zhì)的分類蛋白質(zhì)的組成單位氨基酸肽蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)內(nèi)容提要是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩(wěn)定的構(gòu)象和一定生物功能的生物大分子。纖維狀球狀蛋白質(zhì)(Protein)蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用◆蛋白質(zhì)是生物體的重要組成成分◆蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能1）作為生物催化劑（酶）2）物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和儲存3）運(yùn)動與支持作用4）免疫保護(hù)作用5）代謝調(diào)節(jié)作用6）參與細(xì)胞間信息傳遞◆氧化供能◆蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個部分都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機(jī)分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)80％。2.1.1依據(jù)蛋白質(zhì)的形狀分類

1）球狀蛋白質(zhì)：（globularprotein）外形接近球形或橢圓形，溶解性較好，能形成結(jié)晶，大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于這一類。2）纖維狀蛋白質(zhì)(fibrousprotein)分子構(gòu)象類似纖維或細(xì)棒。它又可分為可溶性纖維狀蛋白質(zhì)和不溶性纖維狀蛋白質(zhì)。3）膜蛋白質(zhì)

2.1蛋白質(zhì)的分類2.1.2依據(jù)蛋白質(zhì)的組成分類

1.簡單蛋白(simpleprotein)：又稱為單純蛋白質(zhì)；這類蛋白質(zhì)只含由

-氨基酸組成的肽鏈，不含其它成分。（1）清蛋白和球蛋白：albuminandglobulin廣泛存在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。（2）谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于70－80％乙醇中。（3）精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質(zhì)，存在與細(xì)胞核中。（4）硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。（1）核蛋白：由簡單蛋白與核酸結(jié)合而成。如細(xì)胞核中的核糖核蛋白等。（2）糖蛋白與蛋白聚糖：由簡單蛋白與糖類物質(zhì)組成。如細(xì)胞膜中的糖蛋白等。糖與蛋白質(zhì)的結(jié)合方式：O連接和N連接（3）脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結(jié)合而成。如血清

-，

-脂蛋白等。（4）色蛋白：由簡單蛋白與色素結(jié)合而成。如血紅素、過氧化氫酶、細(xì)胞色素c等。（5）磷蛋白：由簡單蛋白質(zhì)和磷酸組成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。2.結(jié)合蛋白(conjugatedprotein)：由簡單蛋白與其它非蛋白成分結(jié)合而成2.1.3按功能分類

酶調(diào)節(jié)蛋白貯存蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)運(yùn)動蛋白防御蛋白和毒蛋白受體蛋白支架蛋白結(jié)構(gòu)蛋白異常功能2.2蛋白質(zhì)的組成單位氨基酸氨基酸（aminoacid)

是蛋白質(zhì)的基本組成單位。從細(xì)菌到人類，所有蛋白質(zhì)都由20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸組成。2.2.1氨基酸的結(jié)構(gòu)通式不帶電形式

H2N—Cα—HCOOHR

+H3N—Cα—HCOO-R兩性離子形式氨基酸的結(jié)構(gòu)式書寫20種常見氨基酸的名稱和結(jié)構(gòu)式甘氨酸(a-氨基乙酸)Glycine丙氨酸(a-氨基丙酸)Alanine

亮氨酸(γ-甲基-a-氨基戊酸)*Leucine

異亮氨酸(β-甲基-a-氨基戊酸)*Isoleucine纈氨酸(b-甲基-a-氨基丁酸)*Valine脯氨酸(a-四氫吡咯甲酸)Proline苯丙氨酸(b-苯基-a-氨基丙酸)*Phenylalanine蛋(甲硫)氨酸(a-氨基-γ-甲硫基戊酸)*Methionine

色氨酸[a-氨基-β-(3-吲哚基)丙酸]*Tryptophan絲氨酸(a-氨基-β-羥基丙酸)Serine谷氨酰胺(a-氨基戊酰胺酸)Glutamine天冬酰胺(a-氨基丁酰胺酸)Asparagine蘇氨酸(a-氨基-b-羥基丁酸)*Threonine半胱氨酸(a-氨基-b-巰基丙酸)Cysteine酪氨酸(a-氨基-β-對羥苯基丙酸)Tyrosine天冬氨酸(a-氨基丁二酸)Asparticacid谷氨酸(a-氨基戊二酸)Glutamicacid賴氨酸(a,w-二氨基己酸)*Lysine精氨酸(a-氨基-d-胍基戊酸)Arginine組氨酸[a-氨基-b-(4-咪唑基)丙酸]Histidine20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸蛋白質(zhì)的元素組成：C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、S（0~4%）、…Others:P、Cu、Fe、Zn、Mn、Se、I等蛋白質(zhì)氮占生物組織中所有含氮物質(zhì)的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質(zhì)的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的含氮量接近于16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質(zhì)的大概含量蛋白質(zhì)含量＝蛋白氮×6.256.25

—16％的倒數(shù)，每測定１g氮相當(dāng)于6.25g的蛋白質(zhì)。也就是1g氮所代表的蛋白質(zhì)量（克數(shù)）蛋白質(zhì)含量的測定（自學(xué)）

凱氏定氮法(測定氮的經(jīng)典方法)優(yōu)點：對原料無選擇性，儀器簡單，方法也簡單；缺點：易將無機(jī)氮(如核酸中的氮)都?xì)w入蛋白質(zhì)中,不精確。除了上法外，還有雙縮脲法，F(xiàn)olin—酚，考馬斯亮蘭G—250比色法等總結(jié)從蛋白質(zhì)水解物中分離出來的氨基酸有二十種，除脯氨酸和羥脯氨酸外，這些天然氨基酸在結(jié)構(gòu)上的共同特點為：(1)與羧基相鄰的α-碳原子上都有一個氨基，因而稱為α-氨基酸(2)除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的α-碳原子都為不對稱碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性，[左旋（-）或右旋（+）]B.每一種氨基酸都具有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體。目前已知的天然蛋白質(zhì)中氨基酸都為L-型。2.2.2氨基酸的分類1.根據(jù)R的化學(xué)結(jié)構(gòu)（1）脂肪族氨基酸：

1）疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys；

2）極性：Arg、Lys、Asp、Glu、Asn、Gln、Ser、Thr（2）芳香族氨基酸：Phe、Tyr（3）雜環(huán)氨基酸：Trp、His（4）雜環(huán)亞氨基酸：Pro2.根據(jù)R的極性（1）極性氨基酸：1）不帶電：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；

2）帶正電：His、Lys、Arg；

3）帶負(fù)電：Asp、Glu（2）非極性氨基酸：

Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp總結(jié)屬于芳香族氨基酸的是：

色氨酸Trp、酪氨酸Tyr、苯丙氨酸Phe屬于亞氨基酸的是：

脯氨酸Pro含硫氨基酸包括：

半胱氨酸Cys、甲硫氨酸Met分子量最小的氨基酸是:甘氨酸Gly能形成二硫鍵的氨基酸是:半胱氨酸Cys含二羧基一氨基的氨基酸有:

谷氨酸Glu、天冬氨酸Asp幾種特殊氨基酸

脯氨酸（亞氨基酸）

半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HH幾種特殊氨基酸這些氨基酸都是由相應(yīng)的基本氨基酸衍生而來的幾種特殊氨基酸2.2.3氨基酸的重要理化性質(zhì)

一般物理性質(zhì):☆氨基酸一般有味（無味、甜、苦、鮮等）☆一般均溶于水，溶于酸、堿中；不溶于有機(jī)溶劑?！罡呷埸c（200℃以上）☆氨基酸的旋光性及立體異構(gòu)

除甘氨酸外，氨基酸含有一個手性

-碳原子，因此都具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]，比旋光度是氨基酸的重要物理常數(shù)之一，是鑒別各種氨基酸的重要依據(jù)?！畎被岬墓馕諛?gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在遠(yuǎn)紫外區(qū)(<220nm)均有光吸收。在近紫外區(qū)(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。酪氨酸的max＝275nm，苯丙氨酸的max＝257nm，色氨酸的max＝280nm。

氨基酸在水溶液中或在晶體狀態(tài)時都以離子形式存在，在同一個氨基酸分子上帶有能放出質(zhì)子的—NH3+正離子和能接受質(zhì)子的—COO-負(fù)離子，為兩性電解質(zhì)。(1)兩性解離和等電點調(diào)節(jié)氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解離程度完全相等時，即所帶凈電荷為零，此時氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點（pI）。H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+在晶體狀態(tài)或水溶液中的氨基酸（pH=pI）H2N—CH—COO-R在堿性溶液中的氨基酸（pH＞pI）（當(dāng)氨基酸相互連接成蛋白質(zhì)時，只有其側(cè)鏈基團(tuán)和末端的α-氨基，α-羧基是可以離子化的。）氨基酸等電點的確定：1）酸堿滴定（滴定曲線）2）根據(jù)pK值（該基團(tuán)在此pH一半解離）計算：等電點等于兩性離子兩側(cè)pK值的算術(shù)平均數(shù)。pI=————pK1+pK22or（pI=————）pK2+pK32推導(dǎo)過程pI=1/2(pKl′+pK2′)推導(dǎo)過程

對多氨基和多羧基氨基酸的解離解離原則：注意推導(dǎo)過程舉列：計算丙氨酸的等電點

N+H3N+H3

OH-

[Ala][H+]H3CCCOOHH3CCCOO-+H+K’1=

[Ala+]HHAla+Ala

N+H3NH2OH-

[Ala-][H+]H3CCCOO-H3CCCOO-+H+K’2=[Ala]HHAla

Ala-

結(jié)論中性氨基酸：pK1，為α—羧基的解離常數(shù)，pK2，為α—氨基的解離常數(shù)。pI=(pK1，+pK2，)/2酸性氨基酸：pK1，為α—羧基的解離常數(shù)，pK2，為側(cè)鏈羧基的解離常數(shù)。

pI=(pK1，+pK2，)/2堿性氨基酸：pK2，為α—氨基的解離常數(shù)，pK3，為側(cè)鏈氨基的解離常數(shù)。pI=(pK2，+pK3，)/2應(yīng)用pH>pIaa“-”aa向正極移動pH<pIaa“+”aa向負(fù)極移動pH=pIaa“0”aa不移動溶液的pH偏離pI越遠(yuǎn)，氨基酸帶凈電荷越多，在電場中越容易分離。利用不同的氨基酸在同一pH下所帶電荷不同而分離，如用陰離子交換樹脂柱層析分離氨基酸。等電點時,氨基酸溶解度最小，容易聚集沉淀。自測丙氨酸Ala的pI＝6.02，在pH＝7時，在電場中向（?）極移動。(2)氨基酸的化學(xué)性質(zhì)

氨基酸在溶液狀態(tài)時,存在的平衡1）與茚三酮的反應(yīng)氨基酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應(yīng)，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€碳的醛。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍(lán)紫色化合物。脯氨酸與茚三酮反應(yīng)的產(chǎn)物：N+黃色化合物反應(yīng)要點與應(yīng)用

A.該反應(yīng)由-NH2與-COOH共同參與B.茚三酮是強(qiáng)氧化劑C.用于氨基酸的定性、定量分析該反應(yīng)非常靈敏，可在λ＝570nm測定吸光值測定范圍：0.5~50μg/mlD.脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮直接生成黃色物質(zhì)（不釋放NH3）2）與甲醛的反應(yīng)：氨基酸的甲醛滴定法R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)2A.為α-NH2的反應(yīng)B.在常溫，中性條件，甲醛與α-NH2很快反應(yīng)，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。應(yīng)用

◆氨基酸定量分析氨基酸的甲醛滴定法（間接滴定）A.直接滴定，終點pH過高（12），沒有適當(dāng)指示劑。B.與甲醛反應(yīng)，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。C.釋放一個氫離子，相當(dāng)于一個氨基（摩爾比1：1）◆簡單快速，一般用于測定蛋白質(zhì)的水解或合成的速度..3）與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應(yīng)NO2FO2N+HN2—CH—COOHRNO2O2NHN2—CH—COOHR

+HF弱堿性DNP-氨基酸（黃色）A.為α-NH2的反應(yīng)B.氨基酸α-NH2的一個H原子，在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生芳環(huán)取代，生成黃色的2,4—二硝基苯基氨基酸（DNP—氨基酸，穩(wěn)定）應(yīng)用鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N-末端氨基酸此反應(yīng)首先由Sanger應(yīng)用測定蛋白質(zhì)中氨基酸的排序，確定了胰島素的一級結(jié)構(gòu)5—二甲氨基萘磺酰氯（DNS—Cl，又稱丹磺酰氯）可以代替DNFB試劑測定蛋白質(zhì)的N端氨基酸肽鏈氨基末端殘基的檢測（Sanger法）

黃色:根據(jù)它在薄層層析或紙電泳中的遷移特性進(jìn)行鑒定H2N—CH—COOH+

RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl，為熒光試劑）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOH

RDNS-氨基酸二甲氨基萘磺酰氯的簡稱丹磺酰氯可以取代DNFB測定蛋白質(zhì)N端氨基酸，靈敏度高

與5-二甲氨基萘磺酰氯的反應(yīng)（4）與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應(yīng)—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF重復(fù)測定多肽鏈N端氨基酸排列順序，設(shè)計出“多肽順序自動分析儀”反應(yīng)特點及應(yīng)用為α-NH2的反應(yīng)由Edman于1950年首先提出用于N末端分析，又稱Edman降解法,此法的特點是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。5）與亞硝酸的反應(yīng)NH2—CH—COOH+HNO2R-CH-COOH+N2ROH+H2O應(yīng)用：在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定生成氮氣的體積，可計算氨基酸的量，稱為范斯萊克法。

6）與熒光胺反應(yīng)

◆氨基酸與熒光胺反應(yīng)生成具有熒光的產(chǎn)物，是α-NH2的反應(yīng)◆用于氨基酸定量分析

根據(jù)熒光強(qiáng)度測定氨基酸含量（ng級）（激發(fā)波長λx=390nm，發(fā)射波長λm=475nm）。熒光胺H2N—CHCH2SSHNO2HOOCSNO2COOHCOOH+SSNO2NO2HOOCCOOHH2N—CH—COOH+CH2SHpH8.0硫代硝基苯甲酸(λ412nm)應(yīng)用:-SH的反應(yīng),測定樣品中游離-SH的含量7）與5,5′-雙硫基-雙（2-)硝基苯甲酸反應(yīng)2.3肽2.3.1肽的結(jié)構(gòu)一個氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基脫水縮合而成的化合物稱為肽。

氨基酸之間脫水后形成的鍵稱肽鍵（酰胺鍵）。

多肽（鏈）：多個氨基酸殘基之間以肽鍵連接起來的鏈狀化合物叫多肽或多肽鏈。氨基酸殘基：N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有方向性：

Ala-Tyr-Asp-GlyNCN端C端肽鏈寫法：肽鍵的特點肽鍵平面——由于肽鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，使參與肽鍵構(gòu)成的六個原子（C

1、C、O、N、H、C

2）被束縛在同一平面上，這一平面稱為肽鍵平面或肽單元。

生物活性肽（biologicalactivepeptide,BAP）

是能夠調(diào)節(jié)生物機(jī)體的生命活動或具有某些生理活性的寡肽和多肽的總稱。

2.3.2生物活性肽的功能

（1）谷光甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCOCH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG

—◆分子中具有一個由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的

-氨基脫水縮合的-肽鍵

◆含有自由的巰基，具有很強(qiáng)的還原性，可作為體內(nèi)重要的還原劑，保護(hù)某些蛋白質(zhì)或酶分子中的巰基免遭氧化，使其處于活性狀態(tài)。

谷光甘肽的作用GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+氧化型谷胱甘肽舉例（2）催產(chǎn)素和升壓素

（3）促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）

39肽，活性部位為第4~10位的7肽片段：

Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。（4）腦肽腦啡肽具有強(qiáng)烈的鎮(zhèn)痛作用（強(qiáng)于嗎啡），不上癮。Met-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-內(nèi)啡肽（31肽）具有較強(qiáng)的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用。（5）胰高血糖素由胰島α-細(xì)胞分泌（β-細(xì)胞分泌胰島素），29肽。胰高血糖素調(diào)節(jié)維持血糖濃度。（6）胃腸道活性肽2.4蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)是氨基酸以肽鍵相互連接的線性序列,在蛋白質(zhì)中，多肽鏈折疊形成特殊的形狀（構(gòu)象,conformation）。在結(jié)構(gòu)中，這種構(gòu)象是原子的三維排列，由氨基酸序列決定。2.4.1蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（化學(xué)結(jié)構(gòu)）

蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)多肽鏈中AA的序列，也包括二硫鍵的位置。

在基因編碼的蛋白質(zhì)中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序列決定的。

一級結(jié)構(gòu)中包含的共價鍵主要指肽鍵（peptidebond）和二硫鍵（disulfidebond）HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB鏈15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A鏈711621SSSS牛胰島素的化學(xué)結(jié)構(gòu)—S————S——2.4.2蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象、高級結(jié)構(gòu)）——構(gòu)象是蛋白質(zhì)分子中所有原子在三維空間的排列分布和肽鏈的走向。研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法

一．X射線衍射法：二．研究溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的光譜方法：1．紫外差光譜2．熒光和熒光偏振3．圓二色性4．核磁共振（NMR）共價鍵次級鍵化學(xué)鍵肽鍵一級結(jié)構(gòu)氫鍵二硫鍵二、三、四級結(jié)構(gòu)疏水作用鹽鍵范德華力三、四級結(jié)構(gòu)3.穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力（2）蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象

。主要的化學(xué)鍵：

氫鍵蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折疊(

-pleatedsheet)

-轉(zhuǎn)角(

-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

1）α-螺旋（α-helix）Pauling和Corey于1951年提出是多肽鏈的主鏈原子沿一中心軸盤繞所形成的有規(guī)律的螺旋構(gòu)象

結(jié)構(gòu)特征

⑴螺旋的每圈有3.6個氨基酸殘基，每個氨基酸殘基的高度為0.15nm，螺旋間距離為0.54nm，每個殘基沿軸旋轉(zhuǎn)100°，螺旋直徑0.6nm。（2）每個肽鍵的羰基氧與遠(yuǎn)在第四個氨基酸氨基上的氫形成氫鍵，氫鍵的走向平行于螺旋軸，所有肽鍵都能參與鏈內(nèi)氫鍵的形成。（要點：單鏈，右旋，一圈3.6殘基，上升0.54nm維系力：氫鍵，且全部平行，R－基指向外側(cè)）結(jié)構(gòu)特征螺旋的帽化α-螺旋（α-helix）結(jié)構(gòu)特點—C—(NH—C—CO)3N—OHHR3.613螺旋

(ns)此外還有：310，4.416(3)R側(cè)鏈基團(tuán)伸向螺旋的外側(cè)。RRRRRRRRR螺旋的橫截面(4）絕大多數(shù)天然蛋白質(zhì)中的

-螺旋幾乎都是右手螺旋。結(jié)構(gòu)特征：影響α-螺旋形成的因素在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極性氨基酸，α-螺旋就不穩(wěn)定。（Lys、Glu）在多肽鏈中只要出現(xiàn)pro，α-螺旋就被中斷，產(chǎn)生一個彎曲（bend）或結(jié)節(jié)。Gly的R基太小，難以形成α-螺旋所需的兩面角，所以和Pro一樣也是螺旋的最大破壞者。肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側(cè)鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成α-螺旋。2）β-折疊結(jié)構(gòu)（β-pleatedsheet）

-折疊或

-折疊片，也稱

-結(jié)構(gòu)或

-構(gòu)象。

-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵進(jìn)行交聯(lián)而形成的，或一條肽鏈內(nèi)的不同肽段間靠氫鍵而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒狀折疊構(gòu)象。

-折疊結(jié)構(gòu)幾乎所有肽鍵都參與鏈間氫鍵的形成，氫鍵與鏈的長軸接近垂直.氨基酸側(cè)鏈伸展在折疊片的上面和下面

-折疊有兩種類型：一種為平行式，另一種為反平行式N端在同一端。氨基酸殘基的長度0.325nmN端不在同一端。氨基酸殘基的長度0.347nm絲心蛋白的構(gòu)象絲心蛋白的性能絲心蛋白具有抗張強(qiáng)度高，質(zhì)地柔軟的特性。具有0.7nm的周期。絲心蛋白(fibroin)是蠶絲和蜘蛛絲的一種蛋白質(zhì)。絲心蛋白的構(gòu)象

絲心蛋白是典型的反平行β折疊片，多肽鏈取鋸齒狀折疊構(gòu)象。側(cè)鏈交替地分布在折疊片的兩側(cè)。反平行β折疊片以平行的方式堆積成多層結(jié)構(gòu)。鏈間主要氫鍵連接，層間主要靠范德華力維系。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHO特點：◆肽鏈回折180度,在

-轉(zhuǎn)角部分，由四個氨基酸殘基組成;(常見氨基酸：Pro,Gly)◆以主鏈間氫鍵維持穩(wěn)定。彎曲處的第一個氨基酸殘基的-C=O和第四個殘基的–N-H之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)?！暨@類結(jié)構(gòu)主要存在于球狀蛋白分子中。3）-轉(zhuǎn)角（β-turn）4）β凸起（β-bugle）在某些反平行的β片層中，有一股β折疊中有一個殘基的肽鍵沒有參與和相鄰的β折疊間的氫鍵，致使這一部位有所凸起，這一現(xiàn)象被稱為β凸起(βbulge)。插入的氨基酸殘基4）β凸起（β-bugle）是一種小片的非重復(fù)性結(jié)構(gòu)，能單獨存在，但大多數(shù)經(jīng)常作為反平行β折疊片中的一種不規(guī)則情況而存在。β凸起可認(rèn)為是β折疊股中額外插入的一個殘基，它使得在兩個正常氫鍵之間、在凸起折疊股上是兩個殘基，而另一側(cè)的正常股上是一個殘基。5）無規(guī)卷曲或自由回轉(zhuǎn)(randomcoil)◆指無規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)◆在一般球蛋白分子中，往往含有大量的無規(guī)則卷曲，它使蛋白質(zhì)肽鏈從整體上形成球狀構(gòu)象。◆沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結(jié)構(gòu)。常常是酶的活性部位。（3）超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域超二級結(jié)構(gòu)(super-secondarystructures)

:是指若干相鄰的二級結(jié)構(gòu)中的構(gòu)象單元彼此相互作用，形成有規(guī)則的，在空間上能辨認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體。是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)至三級結(jié)構(gòu)層次的一種過渡態(tài)構(gòu)象層次。超二級結(jié)構(gòu)的基本類型：

、、、

X

超二級結(jié)構(gòu)的基本類型：模體在許多蛋白質(zhì)分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結(jié)構(gòu)的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構(gòu)象，被稱為模體(motif)。鈣結(jié)合蛋白中結(jié)合鈣離子的模體鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域(domain)◆是球狀蛋白質(zhì)的折疊單位。多肽鏈在超二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步繞曲折疊成緊密的近似球形的結(jié)構(gòu)，具有部分生物功能?！魧τ谳^大的蛋白質(zhì)分子或亞基，多肽鏈往往由兩個以上結(jié)構(gòu)域締合而成三級結(jié)構(gòu)?！纛愋停害?螺旋域；β-折疊域；α+β域；α/β域；無規(guī)則卷曲+β-回折域；無規(guī)則卷曲+α-螺旋結(jié)構(gòu)域等（4）蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)多肽鏈在二級結(jié)構(gòu)、超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上，主鏈構(gòu)象和側(cè)鏈構(gòu)象相互作用，沿三維空間多方向卷曲，進(jìn)一步盤曲折疊形成特定的球狀分子結(jié)構(gòu)。是多肽鏈上的所有原子（包括主鏈和側(cè)鏈）在三維空間的分布。疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。主要的化學(xué)鍵：三級結(jié)構(gòu)的特征

含多種二級結(jié)構(gòu)單元，如α螺旋、β折疊等；

有明顯的折疊層次；

是緊密的球狀或橢球狀實體；

分子表面有一空穴(活性部位)；

疏水側(cè)鏈埋藏在分子內(nèi)部，

親水側(cè)鏈暴露在分子表面。

主要由疏水作用力維持實例：肌紅蛋白抹香鯨肌紅蛋白（Myoglobin）的三級結(jié)構(gòu)肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

（1）功能：哺乳動物肌肉中儲存氧并運(yùn)輸氧的蛋白。（2）肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)特點：

a.一條多肽鏈，153個氨基酸殘基，一個血紅素輔基，分子量17800道爾頓。

b.肌紅蛋白的整個分子具有外圓中空的不對稱結(jié)構(gòu)，肽鏈共折疊成8段長度不等的-螺旋體（A-H），最長的有23個氨基酸殘基，最短的有7個氨基酸殘基。拐彎處多由Pro、Ser、Ile、Thr等組成。

c.具有極性側(cè)鏈的氨基酸殘基分布于分子表面，而帶非極性側(cè)鏈的氨基酸殘基多分布于分子內(nèi)部，使肌紅蛋白成為可溶性蛋白。輔基血紅素

Fe原子被稱為原卟啉IX（9）的有機(jī)分子固定的，共稱血紅素（Heme），使血液呈紅色。Fe有六個配位鍵，其中四個與卟啉的吡咯環(huán)的N原子相連。Fe2+稱亞鐵血紅素，F(xiàn)e3+為高鐵血紅素，只有Fe2+的蛋白才能結(jié)合氧肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)氧與肌紅蛋白的結(jié)合—Fe2+與珠蛋白的93位（F8）His的咪唑基N相連；—當(dāng)形成氧合肌紅蛋白（oxy-myoglobin）時，第6個配位鍵與氧結(jié)合；—當(dāng)成高鐵肌紅蛋白時，第6配位鍵被H2O分子占據(jù)；—在氧結(jié)合一側(cè)有一E7His氧結(jié)合部位形成空間位阻區(qū)肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)（5）蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)◆四級結(jié)構(gòu)是指由兩個或兩個以上具有三級結(jié)構(gòu)的多肽鏈按一定方式聚合而成的特定構(gòu)象的蛋白質(zhì)分子。其中每條多肽鏈稱為亞基(subunit)?！裢ǔ喕挥幸粭l多肽鏈，但有的亞基由兩條或多條多肽鏈組成，亞基單獨存在時無生物學(xué)活性。當(dāng)亞基聚合成為具有完整四級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)后，才有功能?！駚喕g的結(jié)合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。●一般來說具有四級結(jié)構(gòu)的蛋白屬于寡聚蛋白。血紅蛋白的結(jié)構(gòu)

Hb分子近似球形；M.W.=65000

Hb由四個亞基組成（二條α亞基和二條β亞基）；

α亞基（141aa）比β亞基（146aa）短，但都比肌紅蛋白鏈（153aa）短；這主要是因為末端H螺旋比較短；

4個血紅素分別位于四條多肽鏈的E和F螺旋之間的裂隙處，并暴露于分子表面。

Hb-α和Hb-β及Mb雖然三級結(jié)構(gòu)相似，但其氨基酸序列卻有很大的不同，約只有27個位置是相同的。四級締合在結(jié)構(gòu)和功能上的優(yōu)越性1、降低比表面積，增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性2、豐富蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，以行使更復(fù)雜的功能。3、提高基因編碼的效率和經(jīng)濟(jì)性。4、使酶的催化基團(tuán)匯集，提高催化效率。5、形成一定的幾何形狀，如細(xì)菌鞭毛。6、適當(dāng)降低溶液滲透壓。7、具有協(xié)同效應(yīng)和別構(gòu)效應(yīng)，實現(xiàn)對酶活性的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是它的氨基酸序列蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)是由氫鍵導(dǎo)致的肽鏈卷曲與折疊Primary

structureSecondary

structure總結(jié)蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)是多肽鏈自然形成的三維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)是亞基的空間排列Polypeptide

(singlesubunit

oftransthyretin)Transthyretin,withfour

identicalpolypeptidesubunitsTertiary

structureQuaternary

structure總結(jié)一個天然蛋白質(zhì)在一定條件下，往往只有一種或很少幾種構(gòu)象。用一個蛋白質(zhì)中各個原子范德華體積的總和，除以蛋白質(zhì)所占體積即得裝配密度，一般0.73~0.77.2.5蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系蛋白質(zhì)分子具有多樣的生物學(xué)功能，需要一定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，還需要一定的空間構(gòu)象。2.5.1蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系1.種屬差異蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對蛋白質(zhì)的功能起決定作用。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異，可以斷定它們在親緣關(guān)系上的遠(yuǎn)近。舉例——胰島素，細(xì)胞色素C

不同生物和人的細(xì)胞色素c中氨基酸組成的差異生物名稱不同氨基酸數(shù)生物名稱不同氨基酸數(shù)黑猩猩0恒河猴1豬、牛、羊10馬12雞13海龜15金槍魚21小蠅25小麥35酵母44從細(xì)胞色素c的一級結(jié)構(gòu)看生物進(jìn)化物種進(jìn)化過程中越接近的生物，細(xì)胞色素的一級結(jié)構(gòu)越相似一級結(jié)構(gòu)相似的多肽或蛋白質(zhì)，其空間構(gòu)象以及功能也相似。

從細(xì)胞色素C的一級結(jié)構(gòu)看生物進(jìn)化2.分子病A、分子病的概念：由于遺傳基因的突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的改變或某種蛋白質(zhì)缺乏引起的疾病。B、例如：鐮刀性貧血病N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)結(jié)論蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定它的空間結(jié)構(gòu)，而特定的空間結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)具有生物活性的保證2.5.2蛋白質(zhì)構(gòu)象與功能的關(guān)系別構(gòu)效應(yīng)：又稱變構(gòu)效應(yīng)，是指寡聚蛋白與配基結(jié)合，改變蛋白質(zhì)構(gòu)象，導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性改變的現(xiàn)象.例：血紅蛋白的別構(gòu)效應(yīng)免疫球蛋白蛋白質(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。喝舻鞍踪|(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機(jī)理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。2.6蛋白質(zhì)的性質(zhì)與分離、分析技術(shù)2.6.1蛋白質(zhì)的性質(zhì)（1）蛋白質(zhì)相對分子量：在10000~1000000之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。超離心法（Svedberg于1940年設(shè)計）：蛋白質(zhì)顆粒在25~50*104g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數(shù)（s）：單位（cm）離心場里的沉降速度。

s=————vω2x

v=沉降速度（dx/dt）ω=離心機(jī)轉(zhuǎn)子角速度（弧度/s）

x=蛋白質(zhì)界面中點與轉(zhuǎn)子中心的距離（cm）沉降系數(shù)的單位常用S，1S=1×10-13（s）蛋白質(zhì)分子量（M）與沉降系數(shù)（s）的關(guān)系M=——————RTsD（1－Vρ）R——氣體常數(shù)（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——絕對溫度D——擴(kuò)散常數(shù)（蛋白質(zhì)分子量很大，離心機(jī)轉(zhuǎn)速很快，則忽略不計）V——蛋白質(zhì)的微分比容（m3·g-1）ρ——溶劑密度（20℃，g·ml-1）

s——沉降系數(shù)凝膠過濾法：分子量對數(shù)對洗脫體積作圖，并用標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)作對照，從圖中就可以查得未知蛋白質(zhì)的分子量。SDS電泳法：為什么可用SDS電泳來測定蛋白質(zhì)的分子量？

SDS的加入→使蛋白質(zhì)變性→兩者結(jié)合（1g蛋白質(zhì)結(jié)合1.4gSDS）→使之復(fù)合物帶大量負(fù)電荷，遠(yuǎn)遠(yuǎn)掩蓋了蛋白質(zhì)本身所帶電荷量和種類，因此在電場中由于與SDS結(jié)合全部帶負(fù)電荷，因此遷移速率只與分子量有關(guān)，以分子量對遷移率作圖成線性關(guān)系，以標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)作對照，通過遷移率查得分子量。凝膠過濾法

凝膠過濾所用介質(zhì)為凝膠珠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)一定型號的凝膠網(wǎng)孔大小一定，只允許相應(yīng)大小的分子進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，大分子則被排阻在外洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體積?。恍》肿釉陬w粒網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大測定蛋白質(zhì)分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積〔Ve〕以相對分子質(zhì)量對數(shù)（logM）對Ve作圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線再測出未知樣品洗脫體積〔Ve〕從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可查出樣品蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑普通蛋白質(zhì)電泳的泳動速率取決于荷質(zhì)比（凈電荷、大小、形狀）用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質(zhì)變性（肽鏈伸展）并與SDS結(jié)合，形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物不同蛋白質(zhì)分子的均帶負(fù)電（SDS帶負(fù)電）；且荷質(zhì)比相同（蛋白質(zhì)分子大，結(jié)合SDS多；分子小，結(jié)合SDS少）不同蛋白質(zhì)分子具有相似的構(gòu)象用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)值對它們的遷移率作圖測出待測樣品的遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出樣品的相對分子質(zhì)量電泳電泳電泳migration優(yōu)點：快速，樣品用量少，可同時測幾個樣品缺點：誤差大，約為±10％（誤差主要來源于遷移距離的測量誤差）此方法只能測得亞基肽鏈的相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)相對分子量最低分子量法：

若某一蛋白質(zhì)中某一特定成分含量為x%，且該組分只有一份，則最低分子量=原子量（分子量）

100/x

蛋白質(zhì)或多肽鏈中aa殘基的平均分子量為110,用蛋白質(zhì)分子量除以110，可粗略估計出其aa殘基數(shù)，在解題時常常遇到這一常數(shù)。

（2）蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)

調(diào)節(jié)溶液的pH，使蛋白質(zhì)所帶的正、負(fù)電荷相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，在電場中既不向陽極移動，也不向陰極移動，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。電泳：帶電顆粒在電場中移動的現(xiàn)象。分子大小不同的蛋白質(zhì)所帶凈電荷密度不同，遷移率即異，在電泳時可以分開。1.自由界面電泳：蛋白質(zhì)溶于緩沖液中進(jìn)行電泳。2.區(qū)帶電泳：將蛋白質(zhì)溶液點在浸了緩沖液的支持物上進(jìn)行電泳，不同組分形成帶狀區(qū)域。（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。電泳（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤電泳：玻璃管中進(jìn)行的凝膠電泳。+

—2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進(jìn)行的電泳。-+等電聚焦電泳：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度5.06.07.0穩(wěn)定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－（3）蛋白質(zhì)的變性(denaturation)

概念：在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。變性的本質(zhì)：破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。造成變性的因素如加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation)。變性蛋白質(zhì)的特點①失去生物活性②溶解度減?、壅扯燃哟螅Y(jié)晶能力減弱④容易被酶水解消化變性的分類：可逆變性：例如，把經(jīng)過短時間煮沸的胰蛋白酶冷卻，可以恢復(fù)天然胰蛋白酶的性質(zhì)(如結(jié)晶性、活性等)。不可逆變性：例如，煮熟的雞蛋變性應(yīng)用變性在醫(yī)學(xué)上有很重要意義。臨床上常用高溫、紫外線、酒精等物理或化學(xué)方法使細(xì)菌或病毒的蛋白質(zhì)變性而失去致病及繁殖能力。在實踐中，也有許多為提高某些生物制品的活性，要防止蛋白質(zhì)的變性，如制取抗血清、疫苗等。蛋白質(zhì)的凝固作用

(proteincoagulation)蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。

（4）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)分子的顆粒直徑已達(dá)1~100nm，處于膠體顆粒的范圍。布朗運(yùn)動、丁道爾現(xiàn)象、電泳現(xiàn)象，不能透過半透膜，具有吸附能力蛋白質(zhì)溶液穩(wěn)定的原因：1）表面形成水膜（水化層）；

2）帶相同電荷。++++++透析由于蛋白質(zhì)分子體積很大,不能透過半透膜,而小分子物質(zhì)能透過半透膜,這樣可把蛋白質(zhì)分子與小分子物質(zhì)分開,這個過程叫透析.+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉（5）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)1.中性鹽沉淀反應(yīng)：加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出鹽析稀鹽可使蛋白質(zhì)表面同性電荷增加，增加蛋白質(zhì)分子間的排斥,同時與水分子間的作用增強(qiáng),而增加溶解性—鹽溶作用；高鹽破壞水膜、中和電荷,蛋白質(zhì)聚集沉淀—鹽析,不同蛋白質(zhì)鹽析的鹽濃度不同,故用不同鹽濃度分級沉淀蛋白質(zhì),分離的蛋白質(zhì)不變性。分段鹽析：調(diào)節(jié)鹽濃度，可使混合蛋白質(zhì)溶液中的幾種蛋白質(zhì)分段析出。如：血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。方法2.有機(jī)溶劑沉淀反應(yīng)

用與水互溶的乙醇、丙酮等奪取水膜,等電點時加入更易沉淀,不同蛋白質(zhì)所需溶劑濃度不同分級沉淀,但易引起變性，與有機(jī)溶劑濃度、作用時間和沉淀溫度有關(guān)條件：低溫（0~4。C），PH=PI3.重金屬鹽沉淀反應(yīng)

蛋白質(zhì)在pH＞pI時為負(fù)離子,可與Cu2+/Hg2+/Ag+/Pb2+等結(jié)合為不溶性蛋白鹽而沉淀4.加某些酸類的沉淀反應(yīng)

蛋白質(zhì)在pH<pI時帶正電荷,可與苦味酸、磷鎢酸、鞣酸、三氯醋酸、磺基水楊酸等結(jié)合沉淀苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸、單寧酸、能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。

可逆沉淀(1)在溫和條件下，通過改變?nèi)芤旱膒H或電荷狀況，使蛋白質(zhì)從膠體溶液中沉淀分離。(2)在沉淀過程中，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都沒有發(fā)生變化，在適當(dāng)?shù)臈l件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。(3)可逆沉淀是分離和純化蛋白質(zhì)的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機(jī)溶劑沉淀法等。

不可逆沉淀(1)在強(qiáng)烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質(zhì)膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，所以又稱為變性沉淀。(3)如加熱沉淀、強(qiáng)酸、堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。反應(yīng)名稱試劑顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)有此反應(yīng)的蛋白質(zhì)或氨基酸雙縮脲反應(yīng)NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個以上肽鍵所有蛋白質(zhì)米倫反應(yīng)HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物紅色

Tyr黃色反應(yīng)濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)(Hopking-Cole反應(yīng))乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

Trp坂口反應(yīng)(Sakaguchi反應(yīng))α-萘酚、NaClO紅色胍基Arg酚試劑反應(yīng)(Folin-Cioculteu反應(yīng))堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍(lán)色酚基、吲哚基Tyr茚三酮反應(yīng)茚三酮藍(lán)色自由氨基及羧基α-氨基酸

（6）蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)—OHN（7）蛋白質(zhì)的含量測定1)考馬斯亮藍(lán)G-250法2）紫外吸收法3）凱氏定氮法4)其它方法蛋白質(zhì)的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。2.6.2蛋白質(zhì)的分離和分析技術(shù)（1）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同進(jìn)行分離