凝膠成像及Quantity-One中文操作說(shuō)明

第一章簡(jiǎn)介凝膠電泳是每個(gè)做分子生物學(xué)的研究者天天都要打交道的基本技術(shù)。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，要向大家介紹的是Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件QuantityOne（Bio-Rad還有一個(gè)做2D凝膠分析的軟件PDQuest）。QuantityOne軟件是常用1D凝膠分析軟件中功能最強(qiáng)大，自動(dòng)化程度最高的軟件。這個(gè)軟件的最新版本可以在Bio-Rad的網(wǎng)（）免費(fèi)下載，以供試用或用戶升級(jí)之用。QuantityOne軟件的主要功能包括定量分析(VolumesQuickGuide)，電泳條帶分析(BandAnalysis)，差顯分析(DifferentialDisplayAnalysis)，克隆計(jì)數(shù)(ColonyCountingAnalysis)等，此外，還可以直接控制Bio-Rad公司的各類圖像儀和ExQuest自動(dòng)切膠儀，使您的凝膠分析工作變得極為輕松。QuantityOne軟件擁有與windows操作系統(tǒng)下絕大多數(shù)應(yīng)用軟件相同的友好界面。插入密碼狗，打開(kāi)QuantityOne軟件，可以看到最上緣藍(lán)色橫條幅是標(biāo)題欄，往下依次是菜單欄和工具欄。File圖像打開(kāi)、保存、引入、打印等操作Match分子量估算、條帶匹配分析Edit圖像普通編輯操作Volumn定量分析View圖像縮放、三維視圖、看光密度值等操作Analysis濃度估算、克隆計(jì)數(shù)等分析Image圖像旋轉(zhuǎn)、翻轉(zhuǎn)、裁切等操作Reports分析結(jié)果輸出Lane泳道分析Window窗口分析Band條帶分析Help幫助、快捷菜單、軟件注冊(cè)等

每個(gè)菜單的主要功能如下：往下一行是工具欄，上面每個(gè)按鈕的功能見(jiàn)下表：

QuantityOne軟件HelpàQuickGuide快捷指南提示如何實(shí)現(xiàn)一個(gè)功能，如定量分析(VolumesQuickGuide)，電泳條帶分析(BandAnalysis)，差顯分析(DifferentialDisplayAnalysis)，克隆計(jì)數(shù)(ColonyCountingAnalysis)等。快捷指南下有1，2，3…步驟，根據(jù)提示完成。使用QuantityOne軟件進(jìn)行電泳結(jié)果分析，通常包括圖像獲取、圖像預(yù)處理、分析、結(jié)果輸出四部分。圖像獲取就是通過(guò)軟件控制掃描儀（GS-800、PharosFX等）或凝膠成像系統(tǒng)（GelDoc、ChemiDoc、VersaDoc等），圖像預(yù)處理就是將掃描或拍照獲得的原始圖像進(jìn)行初步處理，以便更好地進(jìn)行后續(xù)分析。接下來(lái)是分析過(guò)程，根據(jù)分析的方法和目的不同，又可以分為定量分析、條帶分析、克隆計(jì)數(shù)、差異（聚類）分析等等。不管如何分析，最終我們都必須通過(guò)軟件的輸出功能，得到我們想要的結(jié)果。QuantityOne軟件提供了多種結(jié)果輸出方式。在接下來(lái)的幾章里，我們將按照這個(gè)思路，一步步引導(dǎo)您使用這一軟件。

Volume＝選定區(qū)域內(nèi)所有像素信號(hào)強(qiáng)度的總和×像素面積

Volume的單位：int×mm2快捷指南VolumesQuickGuide，能夠指導(dǎo)您對(duì)任意所選區(qū)域進(jìn)行定量分析,此分析可以報(bào)告多種結(jié)果，常用的結(jié)果是相對(duì)濃度和絕對(duì)濃度（須提供標(biāo)準(zhǔn)品）。具體的操作方法如下：1．選擇成像系統(tǒng)或打開(kāi)已保存的文件(軟件可以控制Bio-Rad所有的成像系統(tǒng)如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-800,FX,如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff\o""[1]文件格式，軟件也可進(jìn)行分析處理)2．ZoomBox，縮放，對(duì)圖象進(jìn)行放大觀察3．Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的對(duì)比度黑白4．選擇待分析區(qū)域：

VolumnContourTool等高線勾勒區(qū)域，自動(dòng)連接濃度相同的點(diǎn)，如U1

VolumeFreehandTool自由畫筆選擇區(qū)域，可以勾勒出無(wú)規(guī)則形狀,如U2

VolumeRectTool矩形區(qū)域選擇，如U3

VolumnCircleTool圓形選擇區(qū)域，如U4

按上面4種方法選擇需要定量的區(qū)域。5．雙擊所選區(qū)域，出現(xiàn)如下窗口，定義樣品類型，如未知樣品Unkonwn(U1,U2…即待計(jì)算樣品)，背景Background(B1,B2…，軟件在算濃度時(shí)會(huì)將此區(qū)域的濃度自動(dòng)扣除)或標(biāo)準(zhǔn)樣品Standard（Std1,Std2,如果該樣品是濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品，即定量標(biāo)準(zhǔn)，需在濃度concentration一欄輸入該樣品的濃度）。6．SelectTool選擇不同區(qū)域7．PrintImage打印圖像8．VolumeAnalysisReport定量報(bào)告結(jié)果，打開(kāi)出現(xiàn)如下窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，主要有2個(gè)參數(shù)Volume、adj.Vol.(即adjustedvolume)和Concentration。Volume為定量值，adj.Vol.為扣除背景后的定量值，如有濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品（Std），軟件可報(bào)告Concentration絕對(duì)濃度。參數(shù)選好后，按下按鈕“done”。9．軟件報(bào)告如下圖所示：按右側(cè)輸出按鈕，可將表格保存成txt文件，按左側(cè)打印按鈕，可將報(bào)告打印出來(lái)。二．條帶分析（BandAnalysis）條帶分析是QuantityOne最基本的分析工具，它可以自動(dòng)識(shí)別電泳泳道和識(shí)別條帶，依據(jù)泳道的平均光密度和條帶寬度對(duì)每個(gè)條帶進(jìn)行模式化定量。這種分析方式雖然不如定量分析來(lái)得方便，但這樣可以實(shí)現(xiàn)非常復(fù)雜的電泳分析，滿足各種不同的結(jié)果需要。這種方式的最大優(yōu)點(diǎn)在于它可以完全拋棄人為主觀因素而進(jìn)行全自動(dòng)定量。

用條帶分析的方法進(jìn)行定量的結(jié)果叫TraceQuantity（TraceQty），計(jì)算方法是：首先軟件自動(dòng)計(jì)算條帶上每一橫排像素的平均光密度和平均光密度分布曲線，然后每個(gè)具體條帶的定量值是平均光密度曲線的線下面積的積分，即：

TraceQuantity＝平均光密度×條帶上下邊界的距離

TraceQuantity的單位：OD*mm下面介紹用此功能對(duì)泳道內(nèi)的所有條帶進(jìn)行分子量確定，相對(duì)濃度分析

1．打開(kāi)已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff[1]文件格式，軟件也可進(jìn)行分析處理)2．ZoomBox，縮放，對(duì)圖象進(jìn)行放大觀察3．Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的對(duì)比度黑白4．確定泳道(lane),并對(duì)泳道進(jìn)行各種調(diào)整（實(shí)際實(shí)驗(yàn)中泳道往往不是垂直的而出現(xiàn)各種變形）。按下圖所示在軟件的工具欄中有一LaneTool圖標(biāo)，包含有更多泳道編輯工具。

5．選擇FrameLanes，輸入圖像實(shí)際泳道(lane)數(shù)并確認(rèn)。此時(shí)圖像上泳道的位置上會(huì)出現(xiàn)一條條紅線，每條紅線就代表一根泳道。6．選擇Add/AdjustAnchors，此時(shí)泳道紅線上會(huì)出現(xiàn)一些小圓圈。這些小圓圈稱為錨定點(diǎn)(anchor)，錨定點(diǎn)規(guī)定了泳道走向。當(dāng)泳道不直時(shí)，點(diǎn)擊出現(xiàn)彎曲的泳道部位，就可以增加錨定點(diǎn)。鼠標(biāo)按住錨定點(diǎn)，可以拖動(dòng)錨定點(diǎn)，讓每根紅線始終位于泳道的中間線上。7．LaneBackground去除泳道背景。點(diǎn)擊該按鈕，選擇一條適當(dāng)?shù)挠镜傈c(diǎn)擊之，然后在彈出的對(duì)話框中選“AllLaneOn”，在“RollingDiskSize”中填入適當(dāng)?shù)臄?shù)值\o""[1]。8．DetectBand，檢測(cè)泳道內(nèi)的條帶，打開(kāi)出現(xiàn)如下窗口。通過(guò)調(diào)節(jié)sensitivity靈敏度可調(diào)節(jié)檢測(cè)出的條帶數(shù)，調(diào)節(jié)LaneWidth使代表表帶的紅色橫線與條帶寬度差不多寬。中間一行人工編輯按鈕可以用來(lái)增加/減少條帶、調(diào)節(jié)條帶的上、下邊界等。打開(kāi)工具欄中BandTool條帶編輯工具包可看到更多編輯工具（如上圖）9.

Standard輸入分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件自帶有許多Bio-Rad的分子量標(biāo)準(zhǔn)，如你用的是自己的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入NewStandard建立新的分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件可以選擇標(biāo)準(zhǔn)單位是MW（蛋白質(zhì)）還是BP（核酸）等（左下圖）。在Protein-Standard對(duì)話框中輸入分子量數(shù)值，完成后單擊賦值圖標(biāo)（右下圖），回到圖象文件上單擊標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道，軟件自動(dòng)將所輸?shù)姆肿恿繑?shù)值和泳道內(nèi)的條帶一一對(duì)應(yīng)。10.

BandAttribute條帶屬性，在完成第9步以后，軟件已自動(dòng)計(jì)算出了其他未知條帶的分子量,打開(kāi)bandattribute選擇要報(bào)告的參數(shù)，這里我們選擇MolecularWeight，圖象上可以看到所有條帶的分子量（紅顏色標(biāo)記），標(biāo)準(zhǔn)分子量為藍(lán)色標(biāo)記。11.

PrintImage打印圖象12.

AllLaneReport所有泳道條帶結(jié)果報(bào)告。打開(kāi)窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，如Mol.Wt.（分子量，如左下圖），軟件將報(bào)告結(jié)果（右下圖），在報(bào)告的右下腳有一報(bào)告輸出工具，點(diǎn)擊可將報(bào)告結(jié)果輸出成.txt文本格式或輸出至剪貼板，可粘貼到EXCEL，WORD等文件下。常見(jiàn)問(wèn)題及處理：1

問(wèn)：為什么我新買的QuantityOne軟件幾天前還能用，現(xiàn)在只能使用最基本的功能了？

答：可能是密碼未正確安裝，而試用期已過(guò)。2

問(wèn)：為什么我重新安裝QuantityOne軟件后就不能使用了？

答：可能是安裝了超過(guò)版本限制的高版本QuantityOne。3問(wèn)：我的密碼狗還在，可密碼找不到了，我該如何填寫密碼？

答：可以暫時(shí)將電腦連到Internet上，打開(kāi)QuantityOne軟件，選擇Help》Register》CheckLicense，或直接打電話800-820-5567，向Bio-Rad工程師詢問(wèn)。4問(wèn)：QuantityOne軟件能否分析通過(guò)其它公司成像儀或掃描儀得到的照片？

答：可以，但前提是照片必須是未經(jīng)壓縮的TIFF(tif)文件，且數(shù)據(jù)采集位數(shù)是8位或12位。5問(wèn)：我拍出的圖片，條帶很明顯，為什么軟件總找不到？

答：打開(kāi)QuantityOne軟件，鼠標(biāo)放在圖像上，同時(shí)按下Ctrl.+T，看看條帶數(shù)據(jù)是否大于背景，如果不是，則選擇Image》InvertData，然后同時(shí)按下Ctrl.+B，選擇InvertDisplay。6

問(wèn)：為什么我拍出來(lái)的照片，總有一根根很粗的背景？

答：可能是應(yīng)該使用濾光片而沒(méi)有使用，把照明燈管攝入照片。7問(wèn)：為什么我用ChemiDocXRS拍出來(lái)的照片，總有一條條向電泳條帶的影子？

答：可能是在以前使用動(dòng)態(tài)平場(chǎng)功能時(shí)，未將樣品取出，導(dǎo)