RT-PCR鑒別雞新城疫病毒強弱毒株檢測方法的建立_第1頁
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文檔簡介

RT-PCR立RT-PCR技術(shù)在雞新城疫強弱毒株檢測中的應用。通過優(yōu)化RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄反應和PCR擴增條件，建立了一種有效的RT-PCR處。最近幾年，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，RT-PCR技術(shù)具有快速、準本文旨在探究利用RT-PCR技術(shù)建立新城疫病毒強弱毒株檢測方法，RNA純化試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR雙向引物（強毒株：F5'-TGGCCCACAGCTTATCGCGC-3'，R5'-CGCGTAACCGCGACCCAACT-3'；弱毒株：F5'-CGCCGAGCTCGTCCTTCAAG-3'R5'-CGACGGACCTCAGGGAACTG-3'）RNARNA。在無菌條件下，采用RNA純化試劑盒提取病毒RNA，按照說明書進行操作。RNAcDNA模板。將反RNA與隨機核酸引物（6nt）65℃下混合，退火后加入反轉(zhuǎn)錄酶和反轉(zhuǎn)錄緩沖液，進行反轉(zhuǎn)錄反應。反應條件為：25℃5min，42℃60min，70℃15minPCR設計雙向特異性引物，PCR擴增新城疫病毒的基因。按照下列方法進行PCR擴增：（1）PCR反應條件：94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃60s，共35個循環(huán)；72℃10min；4℃保存。模板DNA1μL10×Taq緩沖液2.52mMdNTPs混合液2正向引物F（20pmol）1μL反向引物R（20pmol）1μLTaq聚合酶（5U/μL）0.2ddH2O25PCRPCR擴增產(chǎn)物的長度，并將其純化，RT-PCR通過實驗，確定逆轉(zhuǎn)錄反應溫度、RNAPCR體系的最佳42℃，RNA抽提方法采用純化試劑盒，PCR體RT-PCRRNA1ng/μLRT-PCR實驗結(jié)果表明，該方法對新城疫病毒強弱毒株都具有高靈敏度和特異性。R擴增過程中，引物與病毒模板特異性結(jié)合，擴增出預期大小的DNA片段（強毒株：460bp；弱毒株：370bp）PCR產(chǎn)物本方法可對不同強度的新城疫病毒進行鑒別。在病毒RNA的初始濃1ng/μL時仍能成功鑒別。實驗結(jié)果表明，PP10-6時，該方法仍RT-PCR技術(shù)是一種快速、準確、高效、靈敏的檢測技術(shù)，在新城疫RT-PCR進行病原鑒定，可以迅速找到感染源，進行及時隔離和治療，從而保障家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。本文采用RNA純化試劑盒提取病毒RNA，避免了使用有機試劑對環(huán)境造成

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