植物病毒去除技術(shù)研究

植物病毒去除技術(shù)研究

植物病毒廣泛分布，破壞嚴重，對世界花卉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了重大影響。近年來,隨著我國從國外引種花卉的種植面積的擴大以及不規(guī)范的繁殖技術(shù),病毒病開始流行,嚴重影響了中國花卉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前國內(nèi)外多用組織培養(yǎng)脫毒方法來阻止病毒病的繼續(xù)傳播以便提高植物的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此,本文對當前植物組織培養(yǎng)脫病毒方法作了綜述,以期從中得到啟示,進一步促進植物脫毒方法及應(yīng)用的相關(guān)研究。植物組織培養(yǎng)脫毒方法有莖尖培養(yǎng)脫毒、熱處理脫毒、冷處理脫毒、化學(xué)藥劑處理脫毒、花藥培養(yǎng)脫毒、愈傷組織脫毒、珠心胚培養(yǎng)脫毒、莖尖微體嫁接脫毒等,其中由于莖尖培養(yǎng)脫毒效果好,是目前植物無病毒苗培育應(yīng)用最廣泛、最重要的一個途徑。研究表明,如果將不同的方法結(jié)合起來應(yīng)用效果會更好,通常將莖尖結(jié)合熱處理來脫毒。1莖尖生長點病毒途徑莖尖培養(yǎng)脫毒原理:在染病毒植株體內(nèi),病毒分布并不均勻,在生長點病毒含量最低。病毒通過維管束和胞間連絲傳播,在分生區(qū)內(nèi)無維管束,病毒擴散慢,加之植物細胞不斷分裂增生,所以病毒含量少,在莖尖生長點幾乎檢測不出病毒,因此切取莖尖愈小愈好,但實際操作中莖尖取太小不易培養(yǎng)成活,過大又不能去毒。1.1莖尖的切除、接種將消毒后的材料放置在20~40倍解剖顯微鏡下,用解剖刀剝?nèi)?.1~1mm的莖尖,迅速放入培養(yǎng)基中,如果在空氣中暴露時間過長,就會因失水引起莖尖死亡。趙軍良等人的研究表明,帶有一個葉原基的莖尖,脫毒效果最好,成活率最高。不同的植物材料莖尖剝?nèi)〉姆椒ê妥钸m合脫毒的莖尖大小不同。在菊花的莖尖培養(yǎng)中,在超凈工作臺內(nèi)將消毒后的莖尖中用肉眼能看到的葉柄切除,在實體解剖鏡下用解剖刀剝離頂芽至露出帶有1~2片葉原基的生長點,生長點大小約在0.3~0.5mm左右,大于以上尺寸脫毒率將會下降,反之成活率將會下降,迅速將摘出的生長點置于培養(yǎng)基中。就香石竹而言,切掉葉柄后,生長點是在幾重葉原基的包圍下,要從外到內(nèi)逐一切掉外層葉原基,當生長點露出時把包括1~2片葉原基在內(nèi)的生長點切下,迅速移入事先預(yù)備好的培養(yǎng)基內(nèi),注意生長點的方向及不要把生長點埋在培養(yǎng)基內(nèi)。在康乃馨的莖尖培養(yǎng)中取帶有1~2個葉原基、長0.2~0.3mm的莖尖接種到培養(yǎng)基上,接種時只須沾取莖尖置于輕輕劃破的培養(yǎng)基表面即可。洋蔥可用0.5~0.7mm莖尖培養(yǎng),能有效地脫除洋蔥中的OYDV和GLV病毒。在對白蔥的莖尖脫毒研究表明,以帶有1片葉原基大小為0.2~0.6mm的莖尖外植體較為適宜。1.2活性炭外植體莖尖培養(yǎng)可能出現(xiàn)褐化、玻璃化等現(xiàn)象,這會嚴重影響植物的成活率,所以必須解決這些問題。褐化是由于外植體在培養(yǎng)過程中分泌的酚、醌類物質(zhì)妨礙自身的生長,而活性炭可以吸附外植體在培養(yǎng)過程中的有害物質(zhì),從而達到防止褐化的目的。在香蕉莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入活性炭或與維生素C配合使用均能改善外植體褐變情況。玻璃化是植物組織培養(yǎng)過程中特有的一種生理失調(diào)或生理病變,很難繼續(xù)用作繼代培養(yǎng)和擴繁材料,生根困難,移栽后也很難成活。實驗表明,采用強光10000~20000lx,在培養(yǎng)中提高糖和瓊脂的濃度,降低細胞分裂素的用量,對克服香石竹莖尖培養(yǎng)玻璃化有明顯效果。2熱處理對莖尖的處理熱處理的原理是病毒由蛋白質(zhì)組成,高溫可以使蛋白質(zhì)變性,所以通過高溫鈍化病毒。熱處理的材料可以是母株(已長芽的塊莖),也可以是已經(jīng)剝離的已長到1cm左右的小植株。高溫?zé)崽幚硎窃诤銣叵鋬?nèi)進行,將籽球或小苗放入恒溫箱中,起點溫度可稍低些,逐漸升至處理溫度,一般在35~54℃條件下熱處理幾小時、幾天甚至幾個月。熱處理通常與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合脫毒,對于單用莖尖或熱療法難以脫除的病毒,可先進行熱力處理,使植株莖尖無毒化,再采用莖尖組織培養(yǎng)法,這樣可以提高脫毒成功的幾率。趙祝成等人用水仙0.2~0.3mm微莖尖培養(yǎng)、37±1℃熱力處理30d,可以有效脫除水仙病毒。香石竹置于38℃環(huán)境中60d,其莖尖中的病毒即可被消除。在熱處理莖尖的過程中,通常溫度越高、時間越長、脫毒效果就越好,但是同時植物的生存率卻呈下降趨勢,所以溫度選擇應(yīng)當考慮脫毒效果和植物耐性2個方面。洪霓等在梨病毒的脫毒研究中采用2種處理,一為恒溫處理,溫度控制在37±1℃;二為變溫處理,溫度為32℃和38℃每隔8h變換1次,發(fā)現(xiàn)變溫處理比恒溫處理植株死亡率低,脫毒效率高。熱處理的缺陷是不能脫除所有病毒。例如在侵染馬鈴薯的病毒之中,對于PLRV、PVA和PVY不進行高溫預(yù)處理,脫毒率也相當高,而高溫預(yù)處理卻可以顯著提高對PAMV、PVX和PVS的去除。一般而言,對于球狀病毒和類似紋狀的病毒以及類菌質(zhì)體所導(dǎo)致的病害才有效,對桿狀和線狀病毒的作用不大。3植物激素對含病毒dna植株的分離和培養(yǎng)其原理是抗病毒藥劑在三磷酸狀態(tài)下會阻止病毒RNA帽子結(jié)構(gòu)形成。常用的抗病毒化學(xué)藥物有三氮唑核苷(病毒唑),5-二氫尿嘧啶(DHT)和雙乙酰-二氫-5-氮尿嘧啶(DA-DHT),環(huán)已酰胺,放線菌素—D,堿性孔雀綠等。其中病毒唑是廣譜性抗病毒藥物,早在20世紀70年代末和80年代初,國外一些科學(xué)家就將這種抗動物病毒的藥物應(yīng)用于植物,成功地脫去了馬鈴薯X病毒、黃瓜花葉病毒和苜蓿花葉病毒等。化學(xué)治療劑常常加到植株生長的培養(yǎng)基上,能提高培養(yǎng)基中去除病毒的能力,可以顯著提高產(chǎn)生無病毒植株的百分率。目前采用病毒抑制劑與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的脫毒方法,可以較容易地脫除多種病毒,而且這種方法對取材要求不嚴,接種莖尖可大于1mm,易于分化出苗,提高存活率。謝嘉華等人的研究表明,三氮唑核苷對黃瓜花葉病毒、馬鈴薯X病毒、煙草花葉病毒等多種病毒的增殖有抑制作用,用添加三氮唑核苷的培養(yǎng)基培養(yǎng)帶毒植株一段時間(2~3個月)后,取萌發(fā)的頂芽移植到不含三氮唑核苷的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng),可增加產(chǎn)生無病毒后代植株的百分率。根據(jù)尚佑芬等人的報道,培養(yǎng)基未加藥劑處理的莖尖苗脫毒率為33.3%,添加1.5%TS病毒鈍化劑處理后脫毒率提高49.5%。一些植物生長激素如NAA、BAP對降低百合外植體中病毒濃度也有一定效果(Chavdarov1995)。也有將莖尖培養(yǎng)與熱處理、化學(xué)藥劑處理相結(jié)合來脫毒的,在MS培養(yǎng)基上,附加5mg·L-1病毒唑培養(yǎng)唐菖蒲,再經(jīng)38~40℃熱處理,切取微莖尖2次,去除了危害唐菖蒲的3種主要病毒TMV、CMV和TVY。4誘導(dǎo)比較比較,脫毒能力提高愈傷組織脫毒已獲成功的有草莓、唐菖蒲、老鸛草等。愈傷組織脫毒的原理是愈傷組織的某些細胞不帶病毒,這是由于病毒的復(fù)制速度趕不上細胞的增殖速度,或者是有些細胞通過突變獲得了抗病毒的抗性。方法是通過花卉各種器官或組織誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織,然后從愈傷組織再誘導(dǎo)分化產(chǎn)生芽,長成小植株,可以得到無病毒苗。劉文萍等人用唐菖蒲花蕾進行離體培養(yǎng),可脫除煙草花葉病毒,脫毒率為60%。枸杞的花藥可以誘導(dǎo)出愈傷組織,從而脫毒。這種方法的缺陷是植株遺傳性不穩(wěn)定,可能會產(chǎn)生變異植株,并且一些植物的愈傷組織尚不能產(chǎn)生再生植株。5設(shè)立菊花矮化病毒和菊花褪綠斑塊病毒低溫處理脫毒的原理目前還不清楚,這方面的報道也不多見。菊花植株在5℃條件下經(jīng)4~5個月處理后,切取莖尖進行培養(yǎng)可除去菊花矮化病毒(CSV)和菊花褪綠斑駁病毒(CCMV)。從理論上來說可以利用超低溫進行脫毒處理,其原理是易感病毒的大細胞內(nèi)含水量大,在超低溫處理的過程中易受凍害而死亡,而不含病毒的小莖尖容易成活,分化成芽,長成脫毒苗。但是目前暫時還沒有這方面的報道。6接種、培養(yǎng)、接種、培養(yǎng)利用高濃度二氧化碳和高溫短期處理的方法脫去病毒,在葡萄上已初見成效。微體嫁接的原理將0.1~0.2mm的莖尖作為接穗,嫁接到由試管中培養(yǎng)出來的無菌實生砧木上,繼續(xù)進行試管培養(yǎng),愈合成為完整的植株,這在桃、柑橘、蘋果等果樹上已獲得成功,并且有的已在生產(chǎn)上應(yīng)用。日本用柑桔莖尖微嫁接繁殖無病毒柑桔營養(yǎng)系,美國用此方法使蘋果無病毒苗工廠化育苗,并在全國普遍開展。7脫毒的藥劑研究從上述脫毒方法可以看出,必須從2方面來考慮脫毒問題:一是殺死病毒的方法,二是植物本身的性質(zhì)。首先是殺死病毒的方法,目前應(yīng)用的有高溫、低溫、超低溫和化學(xué)藥劑等,在應(yīng)用時要考慮植物的臨界溫度及對化學(xué)藥劑的抗性。其中,由于化學(xué)藥劑的選擇范圍廣,對不同植物脫毒效果不同,且目前研究的報道較少,所以這方面還有待進一步的研究。還有很多殺毒方法可以嘗試,如紫外線、pH,在研究這些方法時同樣要考慮植物性質(zhì)。其次是植物本身的性質(zhì),