利用小分子DNA鑒定重金屬離子對DNA的損傷

利用小分子DNA鑒定重金屬離子對DNA的損傷梅運(yùn)軍;張磊;畢歡;謝炳輝;朱玉嬋【摘要】［Objective］TheaimwastoestablishaconvenientandeffectivemethodtoevaluatethetoxicityofheavymetalionsbyusingsmallmolecularDNA.［Method］pUC18DNAwhichhadexposedtothefourheavymetalionsofHg2+,Cr6+,Pb2+,Cd2+wasusedtostudythebioactivityofDNA;simultaneously,gelelectrophoresisandhyperchromiceffectwereemployedtodetectthemechanismofDNAdamage.［Result］ThebioactivityoftheexposedDNAwasdecreasedandtheinfluencedegreewasHg2+>Cr2+>Pb2+>Cd2+;thegelelectrophoresisandhyperehromieeffectprovedthemainreasonleadingtoreducethebioactivitywasDNAcrosslink,theorderwasHg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+.［Conclusion］ThestudyindicatedthatpUC18DNAcouldbeusedtoassaythedamageofDNAcausingbyheavymentalions,whichmaybeapotential,simpleandeffectivetooltoevaluatetoxicityofheavymetalionstoDNA.%［目的］利用小分子DNA鑒定重金屬離子對DNA的損傷.［方法］將pUC18DNA分子暴露于Hg2+、Cr6+、pb2+、Cd2+4種重金屬離子環(huán)境中，經(jīng)—定時(shí)間處理后對DNA分子進(jìn)行生物活性研究，并用凝膠電泳和增色效應(yīng)分析了重金屬離子對分子生物活性影響機(jī)制.［結(jié)果］DNA活性分析表明,4種重金屬對pUC18的影響程度為Hg2+>Cr6+>pb2+>Cd2+;凝膠電泳和增色效應(yīng)結(jié)果表明,4種重金屬離子主要是引起DNA分子交聯(lián)導(dǎo)致其分子生物活性的降低，交聯(lián)程度為Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+.［結(jié)論］該研究表明,pUC18DNA分子可用作鑒定重金屬離子對DNA損傷的依據(jù)，為評價(jià)重金屬對DNA毒害作用提供了一種簡捷有效的技術(shù)方法.【期刊名稱】《安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)》【年(卷)，期】2012(000)006【總頁數(shù)】3頁(P3258-3259,3273)【關(guān)鍵詞】重金屬離子;DNA損傷;pUC18【作者】梅運(yùn)軍;張磊;畢歡;謝炳輝;朱玉嬋【作者單位】武漢工業(yè)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430023;武漢工業(yè)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430023;武漢工業(yè)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430023;武漢工業(yè)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430023;武漢工業(yè)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢430023【正文語種】中文【中圖分類】X835重金屬污染在環(huán)境污染中占有很大比例，在我國，每年因土壤污染而造成農(nóng)業(yè)方面的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)200多億。引起環(huán)境污染的重金屬主要包括Hg、Cd、Pb、Cr、Zn、Cu、Ni、Co、As等元素，大量研究證實(shí)這些重金屬對動植物具有毒性［1］。但有些重金屬是生物體正常生長和代謝必需的微量元素，如Zn至少是150種酶的重要組成部分［2-4］;Cd被發(fā)現(xiàn)在植物酶活性中起著重要的作用［5-6］;大部分重金屬并非生物體生命活動所必需，超過一定濃度會對細(xì)胞有不同程度的毒害。許多重金屬特別是重金屬離子會對細(xì)胞的DNA造成損傷，如引起DNA鏈斷裂、DNA與蛋白質(zhì)、DNA與DNA交聯(lián)。在以往的研究中通常采用動植物個(gè)體培養(yǎng)法或細(xì)胞培養(yǎng)法結(jié)合彗星電泳技術(shù)分析重金屬的DNA遺傳毒性［7-10］，該方法費(fèi)時(shí)且操作復(fù)雜，而且由于個(gè)體間存在差異易導(dǎo)致結(jié)果不穩(wěn)定。該研究以1種分子量較小的、具有生物活性的質(zhì)粒DNA(pUC18)作為對象，探討了4種重金屬離子(Hg2+、Cr6+、Pb2+、Cd2+)對DNA分子的損傷及其機(jī)理，為研究重金屬對細(xì)胞DNA的毒害提供了一種簡捷有效的評價(jià)手段。1.1.1菌株及質(zhì)粒。pUC18購自TaKaRa公司;大腸桿菌(Escherichiacoli)HB101(Amps)，由武漢工業(yè)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院保藏提供。1.1.2試劑。質(zhì)粒純化試劑盒購自Promega公司;蛋白腺、酵母粉購自O(shè)XOID公司氨芐青霉素(1g)購于華北制藥r；NaCl購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;CdCl2購于北京益利化工公司;HgCl2購于貴州市銅仁化學(xué)試劑廠；Pb(NO3)2購于天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;K2Cr2O7購于天津華東試劑廠，均為分析純。以上重金屬鹽均配制成1g/L的母液，于121°C下滅菌20min待用。1.1.3培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白腺10g，酵母提取物5g,NaCl5g,ddH2O1L調(diào)節(jié)pH至7.2,121C下滅菌20min;固體選擇性培養(yǎng)基:將上述LB液體培養(yǎng)基中添加瓊脂粉15g,滅菌，待冷卻至50C左右加入氨芐青霉素(終濃度100pg/ml)o1.2.1重金屬對質(zhì)粒的處理。將上述配制好的重金屬鹽溶液用微量移液器各取300pl分別加入到對應(yīng)的4個(gè)無菌的5mlEppendorf(EP)管中，再加入2.7ml無菌水，此時(shí)EP管中重金屬離子的終濃度均為100mg/L,對照EP管中只加入3ml無菌水;向上述各溶液中分別加入pUC18質(zhì)粒，至終濃度為1ng/pl,室溫下(24.5C)靜置。分別間隔8、32、56、80和104h后取樣分析質(zhì)粒pUC18的轉(zhuǎn)化活性。1.2.2質(zhì)粒純化。按照試劑盒操作說明進(jìn)行質(zhì)粒純化。1.2.3大腸桿菌轉(zhuǎn)化及DNA電泳。各取1pl經(jīng)純化后的DNA樣品進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化，并對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化及DNA電泳參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［11］。1.2.4DNA增色效應(yīng)測定及計(jì)算。取經(jīng)4種重金屬離子處理6、30、54和78h的DNA分子各2份，1份在70°C的水浴上加熱，另一份置于室溫（24.5°C）,30min后分別在紫外分光光度計(jì)上測A260nm。以增色效應(yīng)=［（A260,70C-A260,24.5C）/A260,24.5C］x100%作為DNA作為指DNA增色效應(yīng)指標(biāo)，研究重金屬引起的DNA交聯(lián)［7］。2.1重金屬對DNA轉(zhuǎn)化活性的影響重金屬對DNA轉(zhuǎn)化活性的影響程度如表1所示（均為3個(gè)平行樣的平均值），與對照組相比，各重金屬處理對DNA分子的轉(zhuǎn)化活性具有明顯的影響;對于同一種重金屬而言，隨處理時(shí)間的延長DNA分子生物活性逐漸減弱甚至喪失，除Cd2+外，其他幾種重金屬對DNA分子處理80h后生物活性完全喪失;而對于不同的重金屬離子，其對DNA分子生物活性的影響也有非常明顯的區(qū)別，存在如下關(guān)系Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+。導(dǎo)致DNA分子轉(zhuǎn)化活性喪失主要有2方面的原因:由于重金屬離子與DNA分子間的相互作用，致使DNA鏈內(nèi)及鏈間形成了交聯(lián)，轉(zhuǎn)化后由于交聯(lián)的DNA分子不能在宿主內(nèi)復(fù)制和正常表達(dá)，故不能形成轉(zhuǎn)化子;在這些可變價(jià)金屬離子的作用下DNA分子發(fā)生氧化一還原反應(yīng)而降解，因此也不能得到轉(zhuǎn)化子。2.2凝膠電泳分析DNA分子的損傷通過質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)可以清楚的得出重金屬處理的DNA分子生物活性明顯降低，表明這些重金屬對DNA具有明顯的損傷，特別是Hg2+、Cr6+、Pb2+。為進(jìn)一步探究引起DNA生物活性變化的原因，即經(jīng)重金屬處理的樣中DNA分子是否出現(xiàn)斷鏈、鏈間交聯(lián)或降解，筆者對處理樣進(jìn)行了DNA凝膠電泳分析。分子生物學(xué)中，常用DNA凝膠電泳來鑒定DNA分子大小及分子構(gòu)型。正是利用該原理DNA凝膠電泳也常被用于環(huán)境科學(xué)中定性分析受理化因素引起的DNA損傷，如斷鏈或鏈間交聯(lián)。在電泳過程中，斷鏈或鏈間交聯(lián)的DNA分子由于分子量或構(gòu)型發(fā)生了改變，其電泳遷移率較正常DNA小，在正常DNA的電泳位置后出現(xiàn)彌散的條帶;若DNA發(fā)生了降解，則降解后的小片段DNA較正常DNA分子遷移率快，在正常的DNA帶前方有彌散的條帶。因此，可以利用DNA分子在凝膠中的電泳情況判斷DNA分子的損傷類型。由圖1可知，除對照組外其他處理樣都不同程度的出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，即在正常DNA條帶的后方出現(xiàn)了彌散的DNA，表明經(jīng)重金屬處理后的DNA產(chǎn)生了交聯(lián)或斷裂，未見重金屬引起的DNA降解現(xiàn)象。該結(jié)果證實(shí)了重金屬引起DNA生物活性降低甚至喪失的主要原因在于其導(dǎo)致DNA分子內(nèi)或分子間形成了交聯(lián)，也可能引起分子斷鏈。2.3重金屬處理對DNA分子交聯(lián)的影響由表2可知，對照樣在整個(gè)過程中，在260nm處的吸光度未見明顯變化，表明其DNA數(shù)量及構(gòu)型都未發(fā)生明顯改變;而重金屬處理組樣品隨著處理時(shí)間延長其吸光值都有一定程度的減少，表明DNA分子數(shù)量或構(gòu)型發(fā)生了變化，結(jié)合電泳結(jié)果可知，經(jīng)重金屬處理后的DNA形成了分子交聯(lián)。根據(jù)表2數(shù)據(jù)計(jì)算各重金屬處理樣增色效應(yīng)情況（表3）。表3結(jié)果顯示，對照樣中DNA增色效應(yīng)最明顯，而不同時(shí)間段取樣未見明顯區(qū)別，表明整個(gè)過程中DNA分子未發(fā)生明顯的變化;其他幾種金屬增色效應(yīng)與對照相比都有不同程度的降低，表明了在這些金屬離子的作用下DNA分子發(fā)生了交聯(lián)，其影響程度大小為Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+。該結(jié)果與重金屬對DNA分子轉(zhuǎn)化活性影響效果一致。重金屬是一類重要的環(huán)境污染物，即使在很低濃度時(shí)也對大多數(shù)生物有顯著的遺傳毒性。而在毒性檢測及毒理分析過程中主要采用生物個(gè)體培養(yǎng)法或細(xì)胞培養(yǎng)法來分析重金屬對DNA的毒害作用的（致突變、致畸、致癌），由于生物個(gè)體或細(xì)胞的差異導(dǎo)致各種重金屬對DNA的毒害效應(yīng)存在很大差異，因而不能準(zhǔn)確評價(jià)其對DNA的毒害作用。該研究結(jié)果表明4種重金屬離子對DNA具有不同程度的損傷，部分甚至完全弓|起DNA生物活性的喪失，其影響程度大小為Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+洞時(shí)，利用DNA凝膠電泳試驗(yàn)直觀的反映了引起DNA生物活性喪失的原因，主要是DNA分子內(nèi)或分子間形成了交聯(lián)結(jié)構(gòu)；DNA增色效應(yīng)試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)引起活性喪失是DNA分子形成了交聯(lián)，通過對增色效應(yīng)影響程度分析發(fā)現(xiàn)4種重金屬離子對DNA影響程度存在如下關(guān)系:Hg2+>Cr6+>Pb2+>Cd2+。鑒于此，該試驗(yàn)為利用小分子DNA分析重金屬離子對DNA的影響或評價(jià)環(huán)境中重金屬離子對DNA的毒害提供了一種潛在的簡捷、高效的分析手段。但該方法也存在一定的缺陷，如不能檢測到DNA點(diǎn)突變?！鞠嚓P(guān)文獻(xiàn)】[1]SHARMASS,DIETZKJ.Thesignificanceofaminoacidsandaminoacid-derivedmoleculesinplantresponsesandadaptationtoheavymetalstress[J].JExpBot,2006,57(4):711-726.[2]SUZUKIT,ISHIHARAK,MIGAKIH,etal.Zinctransporters,ZnT5andZnT7,arerequiredfortheactivationofalkalineph,zinc-requiringenzymesthatareglycosylphosphatidyl-inositol-anchoredtothecytoplasmicmembrane[J].JBiolChem,2005,280(1):637-643.[3]NISHIDAK,HASEGAWAA,NAKAES,etal.ZinctransporterZnt5/Slc30a5isrequiredforthemastcell-mediateddelayer-typeallergicreactionbutnottheimmediate-typereaction[J].JExpMed,2009,206(6):1351-1364.[4]BROADLEYMR,WHITEPJ,HAMMONDJP,etal.Zincinplants[J].NewPhytol,2007,173(4):677-702.[5]LANETW,SAITOMA,GEORGEGN,etal.Biochemistry:Acadmiumenzymefrommarinediatom[J].Nature,2005,435(7038):42.[6]WALDRONKJ,RUTHERFORDJC,FORDD,etal.Metalloproteinsandmetalsensing[J].Nature,2009,460(7257):823-830.[7]葛