一株-1,3-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的分離鑒定

一株-1,3-葡聚糖酶高產(chǎn)菌株的分離鑒定

芽桿菌是土壤和植物生態(tài)的優(yōu)勢微生物群。此類細(xì)菌由于可以生成內(nèi)生芽孢,抗逆性強(qiáng),生長繁殖速度快,在土壤和植物表面普遍存在,因此目前國內(nèi)外研究的很多。該菌不僅有防病作用,而且具有明顯的促生增產(chǎn)效果。研究表明,芽孢桿菌的主要生防物質(zhì)是蛋白質(zhì)和多肽類物質(zhì),而且抑菌譜廣。目前應(yīng)用于生防的種類己知有枯草芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌以及其它一些種類。β-1,3-葡聚糖多聚體是大多數(shù)植物病原真菌細(xì)胞壁的主要成份之一,而β-1,3-葡聚糖酶通過催化β-1,3-葡聚糖多聚體的水解將其降解為葡萄糖,從而抑制真菌的生長及增殖。本實驗所用β-1,3-葡聚糖酶基因來源于環(huán)狀芽孢桿菌,將此基因?qū)隕.coli,在E.coli細(xì)胞中,β-1,3-葡聚糖酶可分泌到細(xì)胞外。通過基因工程手段,將β-1,3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入植株,可提高植物的抗病性。將β-1,3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入微生物,可提高微生物的抑菌效果。本研究將β-1,3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入生防芽孢桿菌中,以提高該菌對灰霉病的生防能力。1材料和方法1.1細(xì)菌的抗菌性測定從淄博市溫室番茄土壤中篩選到對灰霉病有拮抗作用的細(xì)菌6株,于PDA培養(yǎng)基平板上檢測各菌株對灰霉病菌(Botrytiscinerea)的拮抗作用,挑選拮抗性比較好的B-04作為本試驗材料。1.2土壤酶活性測定氨芐青霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、四環(huán)素(5μg/ml)購自欣經(jīng)科公司;限制性內(nèi)切酶EcoRI、EcoRⅤ、SalI、dNTP、Taq酶、DNA純化回收試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品;電擊緩沖液(1mmol/LHepes+10%甘油)為Sigma公司產(chǎn)品。1.3識別菌株和其他疾病1.4-1,3-葡聚糖酶基因的合成用兩種限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI雙酶切質(zhì)粒pUC1940,得到兩個片段,經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳回收相應(yīng)的4.1kb的β-1,3-葡聚糖酶基因;同樣雙酶切大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒pBE2和pHY300PLK。連接回收產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。產(chǎn)生水解圈即為含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。重組質(zhì)粒命名為PBE2-glu和pHY300PLK-glu。1.5振蕩培養(yǎng)挑取B-04單個菌落接種到LB培養(yǎng)基中,于30℃振蕩培養(yǎng)20h,然后按1∶10比例接種到100mlLB培養(yǎng)基中,于30℃振蕩培養(yǎng)約3h。冰浴30min,離心收集菌體,用預(yù)冷的超純水洗2次,1mmol/LHepes(pH7.0)洗一次,電擊緩沖液洗2次,然后懸浮到1.0ml電擊緩沖液中,分裝成每份100μl,加入5～10μl質(zhì)粒DNA,放置3min后轉(zhuǎn)移到電擊轉(zhuǎn)化杯中電擊,加入800μlLB培養(yǎng)基30℃恢復(fù)培養(yǎng)45min后涂在含有相應(yīng)抗生素的平板上,于30℃過夜培養(yǎng)。1.6b-05-glu工程菌株抑菌效果測定將帶有病原菌的瓊脂片置于PDA平板的中央,將B-04及本試驗獲得的工程菌株B-04-glu分別對稱點接在距菌片5cm處,培養(yǎng)4d后測量抑菌帶寬度,計算抑制率,抑制率=1-(接細(xì)菌處病原菌擴(kuò)展半徑/未接細(xì)菌處病原菌擴(kuò)展半徑)×100%。1.7工程中徑植物生長曲線及穩(wěn)定性的測定1.8-1，3，葡萄糖酶活性測定2結(jié)果與分析2.1識別菌株和其他疾病2.1.1芽孢、芽孢橢圓型細(xì)菌為直的桿狀,有鞭毛能運動,能生成抗熱的芽孢,芽孢橢圓型,革蘭氏染色均為陽性。經(jīng)Leica公司TCS-SP2型激光共聚焦顯微鏡拍攝(10×100),形態(tài)如下(圖1)。2.1.2生理生化實驗結(jié)果依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》對六菌株分別進(jìn)行碳水化合物利用、乙酰甲基甲醇實驗(V.P.實驗)、甲基紅實驗(M.R.實驗)、吲哚試驗、產(chǎn)H2S試驗、明膠液化、淀粉水解等生理生化實驗,結(jié)果如下(表2)。2.1.3系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建B-0416SrDNA核苷酸序列通過Blast分別與GenBank等數(shù)據(jù)庫調(diào)集的細(xì)菌的16SrDNA序列進(jìn)行比較,采用DNASTAR軟件進(jìn)行多序列匹配排列,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。依據(jù)《Bergey’sManualofDeterminativeBacteriology》第九版和《芽孢桿菌屬》中芽孢桿菌屬內(nèi)特征,結(jié)合生理生化反應(yīng)(表2),可以得出菌株B-04為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。2.2圖4:2重組質(zhì)粒pHY300PLK-glu、pBE2-glu帶有來自pUC1940的4.1kb的β-1,3葡聚糖酶基因(圖3,4)。轉(zhuǎn)化后長出的菌落轉(zhuǎn)移至ABP平板上培養(yǎng),明顯觀察到部分菌落消解β-1,3-葡聚糖在自身周圍產(chǎn)生透明圈(圖5),說明導(dǎo)入的β-1,3葡聚糖酶基因得到了表達(dá)并且分泌到培養(yǎng)基中,挑取產(chǎn)生較大透明圈的菌落培養(yǎng)后提取質(zhì)粒,經(jīng)EcoRI和SalI酶切電泳能檢測到4.1kb的目的片段條帶(圖6,7),將該菌落定名為B-04-glu。2.3pcr檢測葡聚糖酶基因B-04電擊條件800～1800V,50μF,200Ω,2mm,在1500V獲得最大轉(zhuǎn)化率(圖8)。根據(jù)所用β-1,3葡聚糖酶基因,用DNAMAN軟件設(shè)計引物,以轉(zhuǎn)入β-1,3葡聚糖酶基因的工程B-04-glu與野生菌分別作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果見(圖9)。由圖上可見到在約2kb處有一條清晰的亮條帶,與預(yù)期大小吻合,且上下無雜帶。2.4工程菌株的抑菌能力野生菌株B-04與工程菌株B-04-glu對番茄灰霉病的抑制效果見表3,圖10,結(jié)果表明平板上野生菌株與工程菌株對病菌均有一定抑制效果,且經(jīng)改造后的工程菌株抑菌能力有所增強(qiáng),但轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pBE2-glu的工程菌與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pHY300PLK-glu的工程菌抑菌能力無明顯差別。2.5質(zhì)粒穩(wěn)定性菌株的生長曲線在LB液體培養(yǎng)基中測定,結(jié)果顯示(圖11),工程菌株B-04-glu與野生菌株的生長曲線沒有明顯差異,表明增加β-1,3葡聚糖酶基因并沒有影響到B-04的生長。將菌株B-04-glu連續(xù)稀釋培養(yǎng),每隔5h取樣涂板。實驗結(jié)果表明:在該條件下兩種質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性均為90%以上(圖12)。芽孢桿菌在實驗室適宜條件下大約20min分裂1代,而其在自然條件下分裂1代所需時間為50～100h,因此我們認(rèn)為新構(gòu)建的基因工程菌可以滿足作物特定生育期甚至一年生作物全生育期研究的需要。2.6質(zhì)粒phy200-glu,3-葡聚糖酶活測定通過SPSS軟件進(jìn)行線性回歸分析得出回歸直線,并用Matlab繪出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出B-04-glu(轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pHY300PLK-glu)β-1,3葡聚糖酶酶活為1.36,B-04-glu(轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pBE2-glu)β-1,3-葡聚糖酶酶活為1.46(表4)。3-1,3-葡聚糖酶基因檢測植物耐藥能力本試驗中篩選到的蠟樣桿菌B-04對番茄灰霉病有較強(qiáng)的抑制作用,其產(chǎn)生拮抗作用的主要原因可能是產(chǎn)生能抑制病原物發(fā)展的抗菌物質(zhì),包括細(xì)菌素、蛋白酶類等等,使病菌飽子和菌絲畸形,細(xì)胞崩解,內(nèi)含物外瀉,從而使病菌喪失對植物的侵染能力。β-1,3葡聚糖酶基因是植物病害防治中重要的相關(guān)基因之一,將β-1,3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)入生防芽孢桿菌中,使β-1,3-葡聚糖酶在生防菌中得到表達(dá),從而進(jìn)一步曾強(qiáng)其抑制作用。本研究獲得的工程菌株較野生菌株確實提高了對番茄灰霉病的防治能力,而且2種質(zhì)粒中的β-1,3-葡聚糖酶基因表