黃瓜枯萎病菌拮抗放線菌的篩選

黃瓜枯萎病菌拮抗放線菌的篩選

黃瓜萎縮是由頭孢菌屬的黃瓜?；鸵鸬膶?duì)黃瓜植物維管束的侵犯引起的。近年來黃瓜枯萎病的發(fā)生加重,一般可導(dǎo)致黃瓜產(chǎn)量減少10%~20%,嚴(yán)重時(shí)達(dá)30%以上(祁之秋等,2009)。生物農(nóng)藥具有高效,對(duì)環(huán)境友好,不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)越來越受到重視(Ansarietal.,2012)。放線菌(Actinomycetes)是一類具有重要價(jià)值的微生物,易產(chǎn)生抗病原菌成分等生物活性物質(zhì),已成為生物農(nóng)藥開發(fā)的主要來源(Loqmanetal.,2009;Shimizuetal.,2009)。同時(shí)放線菌作為生防菌也可促進(jìn)作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量提高(Berg,2009;Nimnoietal.,2010;王桂蓮等,2011)。本研究中以從浙江西溪濕地、山東鹽堿地、山東勝利油田、黃河下游河床及海南島沙地等不同生態(tài)環(huán)境采集的土樣作為篩選放線菌樣本,篩選出多株對(duì)黃瓜枯萎病病原菌具有良好拮抗作用的放線菌,對(duì)其中一株高效菌株XF-7進(jìn)行了分類鑒定,并研究了其發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)、黃瓜種子發(fā)芽的影響及對(duì)苗期枯萎病的生防效果。1材料和方法1.1菌株和培養(yǎng)基供試病原菌:黃瓜枯萎病病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、黃瓜立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)由中國(guó)計(jì)量學(xué)院生物安全與食品科學(xué)研究所保藏。培養(yǎng)基:高氏一號(hào)培養(yǎng)基用于放線菌的分離;PDA、PD培養(yǎng)基用于拮抗放線菌的篩選和培養(yǎng);發(fā)酵培養(yǎng)基:含馬鈴薯200(g·L-1),葡萄糖20,NaCl0.5,KNO31,MgSO40.5,K2HPO40.5。土樣:所篩菌株的土樣為2010年8—10月于浙江西溪濕地、山東鹽堿地、山東勝利油田、黃河下游河床及海南島沙地采集。采樣過程為去掉表層土,采集深度為10~15cm的土樣。1.2抑菌活性測(cè)定將采集的土樣采用平板稀釋法分離放線菌,分離培養(yǎng)基中加入20μg·mL-1重鉻酸鉀。將長(zhǎng)出的放線菌分別點(diǎn)種于混有黃瓜枯萎病原菌孢子懸液(1×106cfu·mL-1)的PDA平板上,通過觀察抑菌圈大小,挑選抑菌圈較明顯的菌株進(jìn)入復(fù)篩。復(fù)篩采用平板對(duì)峙法(方中達(dá),1998)對(duì)初篩的放線菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定,重復(fù)3次。根據(jù)結(jié)果確定抑菌活性最強(qiáng)的菌株。抑菌率(%)=(1–處理菌落生長(zhǎng)半徑/對(duì)照菌落生長(zhǎng)半徑)×100。1.3菌落生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)將XF-7接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃、180r·min-1搖床培養(yǎng)96h后,7800r·min-1離心7min,再用濾紙過濾得發(fā)酵濾液。如果用于菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn),還需用孔徑0.22μm微孔濾膜過濾除菌。將制得的發(fā)酵濾液稀釋成2-1~2-7的濃度梯度,然后按1︰9的比例混入50℃的PDA培養(yǎng)基中制備平板,同時(shí)設(shè)加無菌水的對(duì)照。平板凝固后在中央接種直徑4mm的黃瓜枯萎病原菌的菌餅。待對(duì)照菌落直徑長(zhǎng)至平板直徑的2/3左右時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。每處理重復(fù)3次。采用十字交叉法,測(cè)定菌落的直徑。菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)=[(對(duì)照菌落直徑–處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑–4)]×100。1.4發(fā)酵濾液處理將發(fā)酵濾液稀釋成2-1~2-9的濃度梯度,取病原菌孢子懸浮液25μL滴加到凹玻片上再分別滴加不同濃度的發(fā)酵濾液25μL,每處理重復(fù)3次,以加無菌水的作對(duì)照。于室溫(28℃)保濕條件下培養(yǎng),24h后觀察病原菌孢子生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)抑制率。1.5制備放線菌xf-7的發(fā)酵濾液挑選飽滿均勻的黃瓜種子,用3%次氯酸鈉消毒10min,無菌水洗凈,25℃下催芽24h后備用。制備放線菌XF-7的發(fā)酵濾液。將黃瓜種子在菌株XF-7發(fā)酵濾液中浸泡30min,置于培養(yǎng)皿中的滅菌濾紙上,25℃培養(yǎng)48h,計(jì)算黃瓜種子的發(fā)芽率,測(cè)量胚芽、胚根長(zhǎng)度。以無菌水浸泡的黃瓜種子為對(duì)照。每次處理30粒,3次重復(fù)。具體參照張璐等(2010)的方法。1.6黃瓜苗病病原菌發(fā)病情況預(yù)防試驗(yàn):在缽栽黃瓜長(zhǎng)出兩片真葉時(shí)做如下處理。(1)用XF-7的發(fā)酵濾液灌根25mL;(2)清水灌根25mL作為陰性對(duì)照;(3)30%乙蒜素1000倍稀釋液灌根25mL作為陽(yáng)性對(duì)照。2d后采用根部切傷接種法接種黃瓜枯萎病病原菌(方中達(dá),1998),于灌藥后7、14和21d統(tǒng)計(jì)預(yù)防效果。治療試驗(yàn):先對(duì)黃瓜幼苗接種枯萎病病原菌,在接種病原菌7d后做如下處理:(1)用XF-7的發(fā)酵濾液灌根25mL;(2)清水灌根25mL做為陰性對(duì)照;(3)30%乙蒜素1000倍稀釋液灌根25mL,作為陽(yáng)性對(duì)照。再過7d第1次統(tǒng)計(jì)病情指數(shù),14d第2次統(tǒng)計(jì)病情指數(shù),21d第3次統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)。分別在第1次和第2次病情統(tǒng)計(jì)結(jié)束后及時(shí)進(jìn)行第2次和第3次灌根處理。每處理10缽,3次重復(fù)。按時(shí)統(tǒng)計(jì)幼苗發(fā)病情況。按病情分級(jí),計(jì)算病情指數(shù)和防效(苗則彥等,2009)。病情指數(shù)=[∑(各級(jí)病株數(shù)×對(duì)應(yīng)各級(jí)值)/(調(diào)查總株數(shù)×發(fā)病最高級(jí)值)]×100。相對(duì)防效(%)=[(對(duì)照病情指數(shù)–處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)]×100。1.7dna提取、純化及測(cè)序菌體形態(tài)和菌落形狀觀察參照周德慶(2002)的方法;菌株生理生化反應(yīng)參照中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組(1975)及Buchanan和Gibbons(1984)的方法。菌株經(jīng)PD培養(yǎng)基28℃下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),8000r·min-1離心2min,收集菌體。參照Sambrook&Russell(2001)的方法提取放線菌基因組DNA。PCR所用正向引物為27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物為1495R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′。PCR擴(kuò)增體系為(50μL):PCRReactionMix25μL,引物F(100μmol·L-1)1μL,引物R(100μmol·L-1)1μL,模板DNA(10ng·μL-1)1μL,TaqDNA聚合酶(5U·μL-1)1μL,ddH2O21μL。95℃預(yù)變性5min;94℃變性1min,56℃退火45s,72℃延伸1.5min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。PCR純化產(chǎn)物提交上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)得的16SrDNA序列輸入GenBank,應(yīng)用Blast軟件進(jìn)行同源性搜索,并用MEGA4軟件進(jìn)行同源性比較,采用Bootstrap構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。2結(jié)果與分析2.1平板對(duì)稱試驗(yàn)從土壤中共分離到放線菌315株,其中對(duì)黃瓜枯萎病菌有拮抗作用的44株。圖1左圖顯示的是篩選方法,通過點(diǎn)種,觀察抑菌圈大小來篩選拮抗菌株。圖1右圖A為所篩出的效果較好的拮抗放線菌的平板對(duì)峙效果,所圈菌株為XF-7;B為同時(shí)接種的黃瓜枯萎病原菌對(duì)照。比較A和B可以看出通過此方法篩出的拮抗放線菌有較好的抑菌效果。平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果如表1顯示,DC-1、XF-7、H-22對(duì)黃瓜枯萎病原菌的抑制效果較好。又同時(shí)觀察了這幾株病原菌對(duì)黃瓜立枯絲核菌(RhizoctoniasolaniKühn)和水稻紋枯病原菌(R.solani)的抑菌效果,綜合比較發(fā)現(xiàn)菌株XF-7對(duì)3種病原菌的拮抗作用均最為明顯,因此選擇XF-7作為后續(xù)試驗(yàn)的菌株。2.2倍時(shí)抑制率XF-7的發(fā)酵濾液對(duì)黃瓜枯萎病原菌菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,由圖2可以看出,稀釋10倍的發(fā)酵液,能完全抑制黃瓜枯萎病原菌的菌絲生長(zhǎng),稀釋20倍時(shí)抑制率仍在80%以上。菌株XF-7發(fā)酵液能強(qiáng)烈抑制黃瓜枯萎病菌孢子的萌發(fā),用其處理24h后,黃瓜枯萎病菌孢子沒有發(fā)生任何萌發(fā)(圖3,A);用清水處理24h后,黃瓜枯萎病菌孢子能萌發(fā)成菌絲體(圖3,B)。由圖4可以看到,當(dāng)XF-7的發(fā)酵液稀釋到32倍時(shí),對(duì)黃瓜枯萎病原菌的孢子萌發(fā)抑制率仍在99%以上,表明XF-7的發(fā)酵代謝產(chǎn)物能強(qiáng)烈抑制黃瓜枯萎病原菌孢子的萌發(fā)。2.3發(fā)酵液對(duì)子發(fā)芽率的影響從表2中可以看出,與對(duì)照相比,菌株XF-7的發(fā)酵液對(duì)黃瓜種子的萌發(fā)沒有負(fù)面影響。經(jīng)XF-7發(fā)酵液處理的種子發(fā)芽率與對(duì)照并無顯著性差異,但胚芽長(zhǎng)度與胚根長(zhǎng)度大于對(duì)照,說明XF-7發(fā)酵液有一定的促生作用。表3顯示,菌株XF-7的發(fā)酵液對(duì)黃瓜枯萎病的預(yù)防效果和治療效果,7d時(shí)分別為96.93%和95.80%,14d時(shí)為90.33%和89.93%,預(yù)防效果好于治療效果,而且與常規(guī)的30%乙蒜素殺菌劑的效果并無顯著性差異。2.4xf-7抗陽(yáng)性放線菌的鑒定2.4.1菌株的形態(tài)特性菌株XF-7的氣生菌絲在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上初為白色,3d后變?yōu)榈凵?在光學(xué)顯微鏡下觀察氣生菌絲呈長(zhǎng)直或波曲狀,多分支;基內(nèi)菌絲無橫隔,不斷裂。孢子絲呈長(zhǎng)直形,成熟的孢子成串珠狀,孢子在電子顯微鏡下的形態(tài)如圖5。孢子表面光滑并呈柱狀。將菌株XF-7接種在不同的培養(yǎng)基上,其形態(tài)特征變化較大(表4),在葡萄糖天門冬素瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)類似細(xì)菌,且不產(chǎn)生氣生菌絲,而在高氏一號(hào)和淀粉瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)非常好,在上述這些培養(yǎng)基上不產(chǎn)生色素。生理生化特性:菌株XF-7能使明膠液化,牛奶凝固并胨化,淀粉水解;在纖維素上不生長(zhǎng);可產(chǎn)生H2S;能利用葡萄糖、果糖、甘露醇,不能利用木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、棉籽糖、肌醇及蔗糖。菌株XF-7在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征分析,對(duì)照《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》(中國(guó)科學(xué)院微生物研究所放線菌分類組,1975)可將該菌株初步鑒定為鏈霉菌粉紅孢Roseosporus類群中的玫瑰Roseus亞群。根據(jù)菌株的生理生化特性,參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(Buchanan&Gibbons,1984),發(fā)現(xiàn)與毒三素鏈霉菌(Streptomycestoxytricini)極為相似。2.4.2srrna的親緣關(guān)系以菌株XF-7的基因組為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖6。菌株XF-7獲得大小約1.5kb的特異性片段,采用雙向測(cè)定法測(cè)得菌株XF-7的16SrDNA序列全長(zhǎng)為1416bp,GenBank中的序列登錄號(hào)為JN315670。經(jīng)Blast同源序列檢索發(fā)現(xiàn),在16SrDNA親緣關(guān)系相近前50個(gè)序列中,全部為鏈霉菌屬菌株,XF-7與它們均有較高的同源性,其中與毒三素鏈霉菌(Streptomycestoxytricini)的同源性最高,達(dá)100%。選取11個(gè)典型菌株的16SrDNA序列用MEGA4軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,結(jié)果如圖7。菌株XF-7與毒三素鏈霉菌(S.toxytricini)單獨(dú)構(gòu)成一個(gè)分支,反映出兩者的親緣關(guān)系最近。結(jié)合形態(tài)和生理生化特性,最終將菌株命名為StreptomycestoxytriciniXF-7。3抗混養(yǎng)菌株的篩選有研究表明植物提取物中的活性成分對(duì)黃瓜枯萎病原菌有一定的抑制作用,但植物有效成分提取操作步驟多,效率低(馬麗娟等,2008;郎劍鋒等,2009)。目前報(bào)道較多的仍是以篩選拮抗微生物為主要手段防治病害的發(fā)生。張璐等(2010)從植物根系土壤中篩選到芽孢桿菌DS-1對(duì)黃瓜枯萎病原菌有顯著的生防效果。宋以星等(2011)從蔬菜種植區(qū)篩選出一株對(duì)黃瓜枯萎病病原菌有強(qiáng)烈抑制作用的芽孢桿菌B1。拮抗放線菌的篩選已經(jīng)成為生物防治植物病害的重要措施之一(何建清等,2010;秦涵淳等,2010)。目前拮抗放線菌的篩選一般是在分離得到放線菌經(jīng)純培養(yǎng)后,采用平板對(duì)峙法測(cè)定每個(gè)菌株的拮抗活性。這種方法工作量大,耗時(shí)耗力,且效果并不顯著(安德榮等,2002;潘榮光和劉明霞,2008)。本研究中嘗試了采用混有黃瓜枯萎病原菌孢子懸液的平板作為指示平板,在篩選出放線菌后通過觀察指示平板上抑菌圈的大小,直接篩選出具有明顯拮抗活性的放線菌,再進(jìn)行純培養(yǎng)。試驗(yàn)證明此篩選方法較為簡(jiǎn)便,效率較高,菌株XF-7正是利用該方法篩選到的一株高效菌株。經(jīng)16SrDNA序列分析鑒定發(fā)現(xiàn),XF-7與毒三素鏈霉菌(Streptomycestoxytricini)的同源性達(dá)100%,與生理生化鑒定結(jié)果相吻合,最終將其命名為StreptomycestoxytriciniXF-7。S.toxytricini是利普司他