大鼠心肌缺血再灌注模型制作的改進(jìn)

大鼠心肌缺血再灌注模型制作的改進(jìn)

在打開冠狀動(dòng)脈并將大鼠心肌缺血重新注入模型的過(guò)程中，文獻(xiàn)報(bào)告的方法有一些改進(jìn)之處。例如，在手術(shù)中，應(yīng)使用呼吸器不僅應(yīng)滿足實(shí)驗(yàn)條件，還應(yīng)對(duì)動(dòng)物造成不必要的傷害。如果冠狀動(dòng)脈中斷，止血后重新形成，連接線很難切割，通常會(huì)破裂左心耳，導(dǎo)致心臟損傷和大出血。根據(jù)文獻(xiàn)，冠狀動(dòng)脈位置不同，模型中缺乏部分和損傷程度不同。本研究就上述方面對(duì)此模型建立方法進(jìn)行了部分改進(jìn)。1材料和方法1.1u3000材料雄性SD大鼠,體重(300±25)g,軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供,許可證號(hào):SCK-(軍)2002-001。心電示波儀(XSJ-5汕頭市無(wú)線電三廠)。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和模型組,每組12只。1.2各組心肌組織病理學(xué)檢測(cè)1.2.1模型復(fù)制:用烏拉坦(1g/kg)腹腔麻醉,背位固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上。將針形電極插入四肢皮下,連接心電圖機(jī),記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。胸部去毛,消毒、沿胸骨左側(cè)旁行切口,上界為兩前肢后緣連線,下界為第五肋間,依次切開皮膚、淺筋膜和深筋膜,用止血鉗鈍性分離肌肉,充分暴露第三、四根肋骨,用剪刀深入肌肉中間剪斷第三、第四肋骨,右手持中號(hào)彎血管鉗深入切口,輕輕用力向兩側(cè)撐開胸腔,即可暴露心臟,輕輕擠壓右側(cè)胸腔,借助心臟跳動(dòng)之勢(shì),將心臟擠出胸腔之外,左手食指、拇指固定心尖,方向朝上偏右,充分暴露心臟,用消毒棉簽輕輕撥開左心耳,從肺動(dòng)脈圓錐左緣進(jìn)針,進(jìn)針深度控制在2~3mm之間,從左心耳右緣中部出針,在結(jié)扎線下墊聚乙烯管(PE50),聚乙烯管可適當(dāng)涂以石蠟油,迅速結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈,隨即可見心臟前壁顏色變成青紫,用彎血管鉗撐開胸前切口,迅速將心臟回納胸腔,順勢(shì)用左手食指和拇指將傷口捏住,向上輕提,使胸腔形成負(fù)壓,排空因開胸進(jìn)入胸腔的空氣,用中號(hào)腸鉗夾住傷口,從開胸到關(guān)胸時(shí)間控制在1min之內(nèi),待大鼠恢復(fù)自主呼吸,連接皮下肢體導(dǎo)聯(lián),記錄大鼠心電圖,Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段弓背抬高0.2mv以上者納入后續(xù)實(shí)驗(yàn),不符合者棄之不用。假手術(shù)組:冠狀動(dòng)脈下只穿線不結(jié)扎。結(jié)扎30min后撤去腸鉗,迅速打開胸腔,輕輕擠壓大鼠右側(cè)胸腔,擠出心臟,左手食指和拇指固定心臟,撥開左心耳,用眼科剪深入聚乙烯管中剪開結(jié)扎線,用眼科鑷夾取聚乙烯塑料管,迅速將心臟回納胸腔,從開胸到關(guān)胸時(shí)間控制在30s~1min之內(nèi),排出胸腔中進(jìn)入的空氣后,用1號(hào)絲線縫合傷口。再灌注120min后可行股動(dòng)脈取血,摘取心臟組織進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。1.2.2心肌組織氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazoliumchloride,TTC)染色:取預(yù)先冷凍于-20℃的心臟標(biāo)本,沿左室長(zhǎng)軸切成1.0mm厚的薄片,置于1%TTC溶液中,37℃孵育20min后,用4%多聚甲醛溶液固定,觀察染色結(jié)果,非梗死心肌組織為紅色,缺血壞死心肌組織為蒼白色。1.2.3心肌組織Nagar-Olsen染色:心肌組織石蠟切片,常規(guī)脫蠟,入明礬蘇木素液10~30s,自來(lái)水洗5min,蒸餾水洗2次,而后堿性復(fù)紅染液浸染3min,蒸餾水洗5~10s,丙酮洗5s,0.1%苦味酸丙酮液迅速分化5~10s。丙酮脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察,黃色部分為正常心肌組織,紅色部分為缺血損傷心肌組織。1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS10.0進(jìn)行方差分析,結(jié)果以xˉ±sxˉ±s表示,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2結(jié)果2.1烏拉坦麻醉大鼠麻醉后呼吸平穩(wěn)。開胸?cái)D壓心臟時(shí),表現(xiàn)為四肢顫動(dòng)、躁動(dòng)、呼吸困難、眼球外凸。行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后呼吸深慢。再灌注期呼吸淺快,閉眼豎毛。大鼠采用烏拉坦進(jìn)行麻醉,呼吸道分泌物少,無(wú)麻醉意外發(fā)生。模型組大鼠再灌注前存活率為83%,再灌注后存活率為75%。假手術(shù)組由于單純穿線,存活率為100%。2.2模型大鼠心肌冠節(jié)支表達(dá)情況假手術(shù)組大鼠實(shí)施假手術(shù)處理后心電圖ST段抬高幅度為(0.103±0.015)mv,模型組大鼠冠脈結(jié)扎后ST段抬高幅度為(0.257±0.045)mv,與假手術(shù)組有顯著性差異(P<0.01)(圖1,見封二)。2.3心肌骨骼成像2.3.1心肌組織染色結(jié)果染色:梗死心肌和正常心肌組織分界清晰。正常大鼠心肌組織經(jīng)MTT染色染成紅色,缺血再灌注后,部分心肌組織染成蒼白色(圖2,見封二),表明部分心肌組織出現(xiàn)梗死。2.3.2nagar-olsen染色正常大鼠心肌組織染成黃色,缺血再灌注組大鼠可見大片心肌組織呈紅染(圖3、4,見封二)。表明大鼠心肌組織出現(xiàn)損傷。3開胸徑需要藥物治療通常文獻(xiàn)報(bào)道建立大鼠心肌缺血再灌注動(dòng)物模型時(shí)需采用氣管切開或者氣管插管的方法,連接呼吸機(jī)給氧,同時(shí)給予阿托品抑制呼吸道分泌物。我們?cè)趯?shí)踐過(guò)程發(fā)現(xiàn),普通呼吸機(jī)模式簡(jiǎn)單,參數(shù)很難控制,進(jìn)口呼吸機(jī)雖調(diào)節(jié)模式精細(xì),但價(jià)格昂貴。采用普通呼吸機(jī)進(jìn)行輔助呼吸,一是對(duì)動(dòng)物造成的創(chuàng)傷大,調(diào)節(jié)呼吸機(jī)時(shí)還會(huì)導(dǎo)致部分動(dòng)物死亡;二是進(jìn)行氣管插管、調(diào)節(jié)呼吸機(jī)等操作均延長(zhǎng)了試驗(yàn)時(shí)間,還易帶來(lái)同組動(dòng)物手術(shù)處理時(shí)間上的差異。在反復(fù)試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),選用250~300g的SD大鼠(一般月齡在2.5~3個(gè)月),此時(shí)的大鼠肌肉和胸壁彈性好,結(jié)扎完畢,心臟回納胸腔時(shí)借助肋骨的彈性和肌肉的收縮性,能很好地封閉胸壁的傷口,關(guān)胸時(shí)可輕輕提起大鼠胸部皮膚以形成真空,從而將大鼠胸腔中的空氣抽吸出去,因此只要手術(shù)者操作嫻熟,在1min之內(nèi)完成開胸結(jié)扎冠脈操作,就可以不采用呼吸機(jī),利用大鼠自身可以短暫進(jìn)行代償氣胸的間隙完成結(jié)扎。在完成冠脈結(jié)扎以后,大鼠在缺血30min的過(guò)程中呼吸可以得到恢復(fù),為再次開胸剪斷結(jié)扎線創(chuàng)造了條件。此方法既降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的要求,減少了實(shí)驗(yàn)操作步驟,又減小了同組動(dòng)物手術(shù)時(shí)間不一帶來(lái)的差異。從心電圖、TTC染色和心肌組織的Nagar-Olsen染色結(jié)果可以看出,采用此方可成功造成心肌缺血,引起心肌梗死。可達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)道的存活率。大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎的部位直接影響模型成功與否以及缺血程度。有報(bào)道在左心耳下2mm處進(jìn)針進(jìn)行結(jié)扎。還有人會(huì)將心臟表面的冠狀靜脈誤認(rèn)為冠狀動(dòng)脈。事實(shí)上大鼠的冠狀動(dòng)脈深埋于心肌深面,結(jié)扎時(shí)要有一定的進(jìn)針深度才能扎到冠狀動(dòng)脈。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎部位不同,引起心肌缺血的部位和范圍不同,左心耳下部進(jìn)行結(jié)扎只是結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支,引起心肌缺血的范圍受大鼠冠脈分支供血范圍的影響,模型重現(xiàn)性不佳。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)選擇在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳之間部位進(jìn)針,也即是結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的起始部位,可引起左室前壁的廣泛缺血。結(jié)扎線的選擇以3/0或者4/0絲線為宜,結(jié)扎線太粗容易損傷心肌和左心耳,結(jié)扎線太細(xì)容易引起心肌結(jié)扎處穿透,導(dǎo)致心肌撕脫傷,冠脈斷裂。結(jié)扎進(jìn)針深度控制在2~3mm為宜。過(guò)深會(huì)引起心肌透壁損傷,造成出血,過(guò)淺結(jié)扎不到冠狀動(dòng)脈,容易導(dǎo)致模型復(fù)制不成功。文獻(xiàn)報(bào)道在實(shí)現(xiàn)結(jié)扎冠脈、冠脈再通的過(guò)程中采用的方法不一,如:將結(jié)扎線的兩端同向穿過(guò)一小段聚乙烯管打結(jié),用一小錐形塑料管深入到結(jié)扎線中間,通過(guò)推進(jìn)和扒出錐形塑料管實(shí)現(xiàn)缺血和再灌注;還有人將結(jié)扎線兩端相向穿過(guò)一小段聚乙烯管,線的兩端穿出胸外,打一寬松的結(jié),用兩端有小鉤的弧形細(xì)鋼絲深入線結(jié)中,放松弧形鋼絲實(shí)現(xiàn)缺血,捏緊鋼絲并且去掉實(shí)現(xiàn)再灌注。兩種方法在收緊和放松結(jié)扎線時(shí)都會(huì)拉動(dòng)心臟和大血管使其移位,引起血流動(dòng)力學(xué)改變,增加了實(shí)驗(yàn)的影響因素。本次實(shí)驗(yàn)取PE50導(dǎo)管約7mm,結(jié)扎線橫穿管壁,使管壁緊貼心臟表面。進(jìn)行冠脈再通時(shí)用眼科剪刀