沉淀反應本科

免疫學及免疫學檢驗REVIEWQUESTION

Thespecificityofthereactionofantigenwithantibodyisusuallyhighlydependentupon

1)molecularweightoftheantigen2)chargeoftheantibody3)immunoglobulinisotype4)conformationofthereactants免疫學及免疫學檢驗沉淀反應（precipitationreaction)毛旭虎醫(yī)學檢驗系臨床微生物學及免疫學教研室二OO六年二月免疫學及免疫學檢驗可溶性抗原+相應抗體

肉眼可見的沉淀免疫學及免疫學檢驗1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)細菌培養(yǎng)液（毒素）與相應抗血清混合出現(xiàn)沉淀1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于其中，發(fā)現(xiàn)沉淀反應可在凝膠中進行1946年Oudin報告了試管免疫擴散技術(shù)1965年Mancini提出單向免疫擴散技術(shù)，使定性免疫試驗向定量化發(fā)展免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉淀反應達到快速、微量、自動化的新階段。免疫學及免疫學檢驗根據(jù)沉淀反應的介質(zhì)和檢測方法的不同,沉淀反應可分為:液相內(nèi)的沉淀反應凝膠內(nèi)的沉淀反應免疫學及免疫學檢驗第一節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗根據(jù)沉淀現(xiàn)象的不同，液體內(nèi)沉淀又可分為三類：絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀免疫學及免疫學檢驗一、絮狀沉淀試驗絮狀沉淀試驗是一項經(jīng)典實驗技術(shù)。曾用于測定梅毒抗體的Kahn試驗是絮狀沉淀的代表試驗，現(xiàn)今已被更簡便而敏感的USR或RPR方法替代。免疫學及免疫學檢驗(一)原理抗原溶液與相應抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。絮狀沉淀易受抗原與抗體比例的影響，由此可作為最適比測定的基本方法。免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.抗原稀釋法(1)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。(2)各管加入一定濃度的適量抗血清。(3)振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。(4)產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。免疫學及免疫學檢驗免疫學及免疫學檢驗2.抗體稀釋法

本法采用抗原量恒定與不同倍比稀釋度的抗體反應，出現(xiàn)沉淀物最多的管為抗體最適比例管。3.方陣滴定法

抗原和抗體同時稀釋，亦稱棋盤(checkerboard)滴定法，是前二法的結(jié)合，可一次完成抗原和抗體的滴定并找出抗原、抗體的最適比。免疫學及免疫學檢驗(三)方法評價

絮狀沉淀試驗方法簡單，設備要求低，敏感度較低，受抗原抗體比例影響非常明顯，目前多用以測定抗原抗體反應的最適比。免疫學及免疫學檢驗二、環(huán)狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀(ringprecipitation)試驗是由Ascoli于1902年建立的一種經(jīng)典的血清學定性試驗。用非常簡便的技術(shù)了解待測血清內(nèi)是否存在某種抗原或抗體。免疫學及免疫學檢驗(一)原理把抗原溶液小心地加于已含抗體溶液的細試管液面上。當對應的抗原與抗體相遇，在界面處形成清晰的乳白色沉淀環(huán)。免疫學及免疫學檢驗(二)操作步驟1.用毛細滴管吸取抗血清加于沉淀管(內(nèi)徑約1.5~2mm)底部，避免產(chǎn)生氣泡。2.將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。3.置沉淀管于室溫下使其反應，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。

免疫學及免疫學檢驗(三)方法評價

該試驗是經(jīng)典的血清學反應之一，簡便、快速、實用。故用于鑒定血跡和診斷炭疽(Ascoli試驗)。只能定性，不能定量、敏感性較低(3~20mg/L)，對含有多個抗原抗體對的反應系統(tǒng)缺乏分辨力。方法難以推廣。

免疫學及免疫學檢驗三、免疫濁度試驗經(jīng)典的免疫沉淀試驗是抗原和相應抗體在反應終點時判定結(jié)果，方法存在耗時、敏感度低(10~100mg/L)和不能自動化等缺點。70年代以來，根據(jù)抗原和抗體所在液相內(nèi)快速結(jié)合并產(chǎn)生濁度的原理，建立了免疫比濁法。臨床常用3種微量免疫技術(shù)，即透射比濁法(transmissionturbidimetry)、散射比濁法(nephelometry)和免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)，借助多種自動化分析儀器來完成。免疫學及免疫學檢驗(一)透射比濁法1.原理抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復合物(IC)，當光線透過反應溶液時，由于溶液內(nèi)復合物粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復合物的量成正比，當抗體量固定時，與待檢抗原量成正比。用抗原標準品建立標準曲線，可測出待檢抗原含量。免疫學及免疫學檢驗2.操作步驟(1)用稀釋緩沖液將待檢樣品和標準品按規(guī)定稀釋，取一定量加至測定管中。(2)加最適工作濃度(用方陣法預先滴定)的抗體，孵育一定時間，測定吸光度(A)值。(3)以不同濃度抗原含量為橫軸，吸光度為縱軸，繪標準曲線。從標準曲線可得待檢抗原量。免疫學及免疫學檢驗3.方法評價

敏感度高于單相瓊脂擴散試驗5~10倍，批內(nèi)、批間重復性較好，變異系數(shù)<10%，操作簡便快速，1h可報告結(jié)果。免疫學及免疫學檢驗(二)散射比濁法散射光系指一定波長的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復合物，光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，這種偏轉(zhuǎn)的角度可因光線波長和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測粒子發(fā)出的散射光，散射光的強度與復合物的含量呈正比，即待測抗原越多，形成復合物越多，散射光強度越強。又可分為速率散射比濁法(ratenephelome-try)和終點散射比濁法(endpointnephelometry)。免疫學及免疫學檢驗1.速率散射比濁法(1)原理：是一種抗原抗體結(jié)合動態(tài)測定法。所謂速率是抗原抗體結(jié)合反應過程中，在單位時間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。速率法是測定最大反應速率，即在抗原抗體反應達最高峰時，通常為數(shù)十秒鐘，測定其復合物形成的量。峰值的高低在抗體過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現(xiàn)的時間與抗體的濃度及其親和力直接相關(guān)。不同抗原含量其速率峰值不同，通過微電腦處理，求出抗原含量。免疫學及免疫學檢驗(2)操作步驟：1)用稀釋液將待檢抗原稀釋成一定濃度。2)將稀釋待檢抗原和不同濃度抗原標準品加至試管內(nèi)，再加入一定量抗體，立即比濁，記錄速率單位(RU)。3)以抗原標準品含量為橫坐標，RU值為縱坐標，于普通坐標紙上繪制標準曲線。根據(jù)待測抗原RU值，查出相應抗原含量。免疫學及免疫學檢驗(3)方法評價：

檢測不必等到抗原抗體反應達到平衡，大大節(jié)約反應時間，每小時可檢測數(shù)十份標本；敏感度高，最小檢出量達μg/L水平。免疫學及免疫學檢驗2.終點散射比濁法(1)原理：讓抗原抗體作用一定時間，使其反應達到平衡后，測定其復合物的量。復合物的濁度不再受時間的影響，但反應復合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前(大約反應數(shù)十分鐘)進行濁度測定。免疫學及免疫學檢驗(2)操作步驟1)用稀釋液稀釋待檢抗原和抗原標準品。2)取一定量稀釋待檢抗原液和不同濃度抗原標準品溶液加至試管中，加抗體充分混勻，孵育一定時間，比濁。3)以抗原標準品量為橫坐標，濁度值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)待檢抗原的濁度值，查出抗原含量。免疫學及免疫學檢驗(3)方法評價：

敏感度達mg/L水平，可自動化，但反應時間較長免疫學及免疫學檢驗(三)免疫膠乳比濁法1.原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當遇到相應抗原時，則發(fā)生凝集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內(nèi)，光線可透過，當兩個膠乳凝集時，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。免疫學及免疫學檢驗2.操作步驟1)用稀釋液將待測抗原和抗原標準品稀釋。2)將抗體致敏膠乳溶液和待測抗原、不同濃度的抗原標準品反應一段時間，測吸光度值。3)以抗原標準品量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，查出待測抗原量。免疫學及免疫學檢驗3.方法評價

敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應液中無PEG沉淀劑的影響，個體IC對結(jié)果影響也小，所以結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設備，一般分光光度計、自動化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

免疫學及免疫學檢驗第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗凝膠內(nèi)