沉淀反應(yīng)本科

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)REVIEWQUESTION

Thespecificityofthereactionofantigenwithantibodyisusuallyhighlydependentupon

1)molecularweightoftheantigen2)chargeoftheantibody3)immunoglobulinisotype4)conformationofthereactants免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)沉淀反應(yīng)（precipitationreaction)毛旭虎醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系臨床微生物學(xué)及免疫學(xué)教研室二OO六年二月免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)可溶性抗原+相應(yīng)抗體

肉眼可見的沉淀免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)1897年Kraus就發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)液（毒素）與相應(yīng)抗血清混合出現(xiàn)沉淀1905年Bechhold把抗體放在明膠中，將抗原加于其中，發(fā)現(xiàn)沉淀反應(yīng)可在凝膠中進(jìn)行1946年Oudin報(bào)告了試管免疫擴(kuò)散技術(shù)1965年Mancini提出單向免疫擴(kuò)散技術(shù)，使定性免疫試驗(yàn)向定量化發(fā)展免疫濁度法的出現(xiàn)，使沉淀反應(yīng)達(dá)到快速、微量、自動(dòng)化的新階段。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)根據(jù)沉淀反應(yīng)的介質(zhì)和檢測(cè)方法的不同,沉淀反應(yīng)可分為:液相內(nèi)的沉淀反應(yīng)凝膠內(nèi)的沉淀反應(yīng)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)第一節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗(yàn)根據(jù)沉淀現(xiàn)象的不同，液體內(nèi)沉淀又可分為三類：絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)一、絮狀沉淀試驗(yàn)絮狀沉淀試驗(yàn)是一項(xiàng)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)技術(shù)。曾用于測(cè)定梅毒抗體的Kahn試驗(yàn)是絮狀沉淀的代表試驗(yàn)，現(xiàn)今已被更簡(jiǎn)便而敏感的USR或RPR方法替代。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(一)原理抗原溶液與相應(yīng)抗體溶液混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)可見的絮狀沉淀。絮狀沉淀易受抗原與抗體比例的影響，由此可作為最適比測(cè)定的基本方法。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(二)操作步驟1.抗原稀釋法(1)將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。(2)各管加入一定濃度的適量抗血清。(3)振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。(4)產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同，以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)2.抗體稀釋法

本法采用抗原量恒定與不同倍比稀釋度的抗體反應(yīng)，出現(xiàn)沉淀物最多的管為抗體最適比例管。3.方陣滴定法

抗原和抗體同時(shí)稀釋，亦稱棋盤(checkerboard)滴定法，是前二法的結(jié)合，可一次完成抗原和抗體的滴定并找出抗原、抗體的最適比。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(三)方法評(píng)價(jià)

絮狀沉淀試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，敏感度較低，受抗原抗體比例影響非常明顯，目前多用以測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的最適比。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)二、環(huán)狀沉淀試驗(yàn)環(huán)狀沉淀(ringprecipitation)試驗(yàn)是由Ascoli于1902年建立的一種經(jīng)典的血清學(xué)定性試驗(yàn)。用非常簡(jiǎn)便的技術(shù)了解待測(cè)血清內(nèi)是否存在某種抗原或抗體。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(一)原理把抗原溶液小心地加于已含抗體溶液的細(xì)試管液面上。當(dāng)對(duì)應(yīng)的抗原與抗體相遇，在界面處形成清晰的乳白色沉淀環(huán)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(二)操作步驟1.用毛細(xì)滴管吸取抗血清加于沉淀管(內(nèi)徑約1.5~2mm)底部，避免產(chǎn)生氣泡。2.將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清晰的交界面。3.置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，1~5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(三)方法評(píng)價(jià)

該試驗(yàn)是經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)之一，簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用。故用于鑒定血跡和診斷炭疽(Ascoli試驗(yàn))。只能定性，不能定量、敏感性較低(3~20mg/L)，對(duì)含有多個(gè)抗原抗體對(duì)的反應(yīng)系統(tǒng)缺乏分辨力。方法難以推廣。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)三、免疫濁度試驗(yàn)經(jīng)典的免疫沉淀試驗(yàn)是抗原和相應(yīng)抗體在反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)判定結(jié)果，方法存在耗時(shí)、敏感度低(10~100mg/L)和不能自動(dòng)化等缺點(diǎn)。70年代以來，根據(jù)抗原和抗體所在液相內(nèi)快速結(jié)合并產(chǎn)生濁度的原理，建立了免疫比濁法。臨床常用3種微量免疫技術(shù)，即透射比濁法(transmissionturbidimetry)、散射比濁法(nephelometry)和免疫膠乳比濁法(immunolatexturbidimetry)，借助多種自動(dòng)化分析儀器來完成。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(一)透射比濁法1.原理抗原抗體在一定緩沖液中形成免疫復(fù)合物(IC)，當(dāng)光線透過反應(yīng)溶液時(shí)，由于溶液內(nèi)復(fù)合物粒子對(duì)光線的反射和吸收，引起透射光減少，免疫復(fù)合物量越多，透射光越少，即光線吸收越多，可用吸光度表示。吸光度和復(fù)合物的量成正比，當(dāng)抗體量固定時(shí)，與待檢抗原量成正比。用抗原標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可測(cè)出待檢抗原含量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)2.操作步驟(1)用稀釋緩沖液將待檢樣品和標(biāo)準(zhǔn)品按規(guī)定稀釋，取一定量加至測(cè)定管中。(2)加最適工作濃度(用方陣法預(yù)先滴定)的抗體，孵育一定時(shí)間，測(cè)定吸光度(A)值。(3)以不同濃度抗原含量為橫軸，吸光度為縱軸，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可得待檢抗原量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)3.方法評(píng)價(jià)

敏感度高于單相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)5~10倍，批內(nèi)、批間重復(fù)性較好，變異系數(shù)<10%，操作簡(jiǎn)便快速，1h可報(bào)告結(jié)果。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(二)散射比濁法散射光系指一定波長(zhǎng)的光沿水平軸照射，碰到小顆粒的免疫復(fù)合物，光線被折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，這種偏轉(zhuǎn)的角度可因光線波長(zhǎng)和顆粒大小不同而有所區(qū)別。散射濁度法是在入射光的一定角度檢測(cè)粒子發(fā)出的散射光，散射光的強(qiáng)度與復(fù)合物的含量呈正比，即待測(cè)抗原越多，形成復(fù)合物越多，散射光強(qiáng)度越強(qiáng)。又可分為速率散射比濁法(ratenephelome-try)和終點(diǎn)散射比濁法(endpointnephelometry)。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)1.速率散射比濁法(1)原理：是一種抗原抗體結(jié)合動(dòng)態(tài)測(cè)定法。所謂速率是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)過程中，在單位時(shí)間內(nèi)兩者結(jié)合的速度。速率法是測(cè)定最大反應(yīng)速率，即在抗原抗體反應(yīng)達(dá)最高峰時(shí)，通常為數(shù)十秒鐘，測(cè)定其復(fù)合物形成的量。峰值的高低在抗體過量情況下與抗原的量成正比。峰值出現(xiàn)的時(shí)間與抗體的濃度及其親和力直接相關(guān)。不同抗原含量其速率峰值不同，通過微電腦處理，求出抗原含量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(2)操作步驟：1)用稀釋液將待檢抗原稀釋成一定濃度。2)將稀釋待檢抗原和不同濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品加至試管內(nèi)，再加入一定量抗體，立即比濁，記錄速率單位(RU)。3)以抗原標(biāo)準(zhǔn)品含量為橫坐標(biāo)，RU值為縱坐標(biāo)，于普通坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)抗原RU值，查出相應(yīng)抗原含量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(3)方法評(píng)價(jià)：

檢測(cè)不必等到抗原抗體反應(yīng)達(dá)到平衡，大大節(jié)約反應(yīng)時(shí)間，每小時(shí)可檢測(cè)數(shù)十份標(biāo)本；敏感度高，最小檢出量達(dá)μg/L水平。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)2.終點(diǎn)散射比濁法(1)原理：讓抗原抗體作用一定時(shí)間，使其反應(yīng)達(dá)到平衡后，測(cè)定其復(fù)合物的量。復(fù)合物的濁度不再受時(shí)間的影響，但反應(yīng)復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀之前(大約反應(yīng)數(shù)十分鐘)進(jìn)行濁度測(cè)定。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(2)操作步驟1)用稀釋液稀釋待檢抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品。2)取一定量稀釋待檢抗原液和不同濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液加至試管中，加抗體充分混勻，孵育一定時(shí)間，比濁。3)以抗原標(biāo)準(zhǔn)品量為橫坐標(biāo)，濁度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待檢抗原的濁度值，查出抗原含量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(3)方法評(píng)價(jià)：

敏感度達(dá)mg/L水平，可自動(dòng)化，但反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)(三)免疫膠乳比濁法1.原理選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒，吸附抗體后，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，則發(fā)生凝集，單個(gè)膠乳顆粒在入射光波長(zhǎng)之內(nèi)，光線可透過，當(dāng)兩個(gè)膠乳凝集時(shí)，則使透過光減少。這種減少的程度與膠乳凝集成正比，與抗原量成正比。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)2.操作步驟1)用稀釋液將待測(cè)抗原和抗原標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。2)將抗體致敏膠乳溶液和待測(cè)抗原、不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)一段時(shí)間，測(cè)吸光度值。3)以抗原標(biāo)準(zhǔn)品量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，查出待測(cè)抗原量。免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)3.方法評(píng)價(jià)

敏感度高，試劑穩(wěn)定，因反應(yīng)液中無PEG沉淀劑的影響，個(gè)體IC對(duì)結(jié)果影響也小，所以結(jié)果穩(wěn)定、可靠，特異性好；不需特殊儀器設(shè)備，一般分光光度計(jì)、自動(dòng)化生化分析儀或散射比濁儀均可使用。

免疫學(xué)及免疫學(xué)檢驗(yàn)第二節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn)?zāi)z內(nèi)