PCR、RT-PCR常見問題及分析

PCR常見問題分析及解決方案重慶升博生物科技有限公司SHENGBOBIOTECHCO.,LTD.PCR技術(shù)的發(fā)明1983KaryMullis發(fā)明1985開始有文章發(fā)表1993獲諾貝爾獎(jiǎng)廣泛用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域pcr動(dòng)畫.exePCR技術(shù)的基本原理模板DNA的變性：93℃-95℃左右，模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：Ta=Tm-3~5℃

引物的延伸：TaqDNA聚合酶之5’-3’DNA聚合酶活性變性--退火--延伸三個(gè)步驟

1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的基本原理適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系DNA模板引物反應(yīng)緩沖液Mg2＋dNTP耐熱聚合酶ddH2O反應(yīng)體系對(duì)PCR擴(kuò)增的影響DNA模板純度

蛋白、多糖、酚類等抑制PCR反應(yīng)完整性

模板降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物濃度濃度適當(dāng)

引物設(shè)計(jì)

長(zhǎng)度適當(dāng)、避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體合成質(zhì)量濃度50uL體系引物加量為10-20pmol反應(yīng)體系對(duì)PCR擴(kuò)增的影響反應(yīng)BufferpH、鹽離子、穩(wěn)定劑、增強(qiáng)劑提供緩沖環(huán)境Mg2＋濃度過高非特異性嚴(yán)重過低無擴(kuò)增產(chǎn)物dNTPMixture濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融ddH2OpH值適當(dāng)，避免污染反應(yīng)BufferpH、鹽離子、穩(wěn)定劑、增強(qiáng)劑提供緩沖環(huán)境Mg2＋濃度過高非特異性嚴(yán)重過低無擴(kuò)增產(chǎn)物dNTPMixture濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融ddH2OpH值適當(dāng)，避免污染反應(yīng)BufferpH、鹽離子、穩(wěn)定劑、增強(qiáng)劑提供緩沖環(huán)境Mg2＋濃度過高非特異性嚴(yán)重過低無擴(kuò)增產(chǎn)物dNTPMixture濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融ddH2OpH值適當(dāng)，避免污染如何選擇最合適的DNA聚合酶PCR用耐熱DNA聚合酶（PCR實(shí)驗(yàn)的不同需求）1Taq酶2pfu酶3HotstartTaq酶TaqplusLongTaqTaqplatinum4混合酶1

Taq酶——擴(kuò)增效率最高發(fā)現(xiàn)1969年，美國(guó)黃石國(guó)家公園溫泉活性5‘-3’DNA聚合酶活性強(qiáng)5‘-3’DNA外切酶活性弱熒光探針（定量PCR方法）3‘-5’DNA外切酶活性無錯(cuò)配率每個(gè)循環(huán)約1/60003‘末端加“A”能產(chǎn)物可直接進(jìn)行“TA”克隆生產(chǎn)質(zhì)檢誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)、三次柱純化，分離獲得94kD重組蛋白。無核酸酶和細(xì)菌DNA污染能有效擴(kuò)增人基因組單拷貝基因室溫放置一周，無明顯活性改變。2pfu酶——保真度高

原理具3’－5’核酸外切酶活性，即校正功能。效率相對(duì)較低3‘末端不加“A”，加A后才可進(jìn)行TA克隆。用途表達(dá)基因的克隆基因的定點(diǎn)突變細(xì)胞內(nèi)基因點(diǎn)突變分析（SNP）3HotStartTaq酶——特異性高熱啟動(dòng)Taq酶原理蠟封抗體抑制化學(xué)修飾提高PCR特異性，減少甚至避免非特異性擴(kuò)增3‘加“A”，可直接做“TA”克隆用途混雜模板半定量、定量PCR4混合酶——高擴(kuò)增效率＋高保真度TaqplusTaq+pfu用于復(fù)雜模板（GCrich,二級(jí)結(jié)構(gòu)）擴(kuò)增大多數(shù)情況下可替代Taq,特別是產(chǎn)物在6Kb以上時(shí)，可擴(kuò)10-20kb。LongTaqTaq+pfu超長(zhǎng)片斷擴(kuò)增，15-40kb.TaqplatinumHotStart+pfu高擴(kuò)增效率＋高保真度根據(jù)PCR實(shí)驗(yàn)的不同需求基因組擴(kuò)增、RT-PCR———————特異性基因突變、測(cè)序、表達(dá)克隆—————保真性構(gòu)建基因圖譜、測(cè)序等——長(zhǎng)片段擴(kuò)增復(fù)雜模板擴(kuò)增(GC含量高、二級(jí)結(jié)構(gòu))—擴(kuò)增效率預(yù)配的PCR反應(yīng)液DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液dNTPPCR增強(qiáng)劑

PCRMasterMix特點(diǎn)

快速簡(jiǎn)便

減少加樣誤差和污染

靈敏度高可擴(kuò)增低至2個(gè)拷貝的目的模板

特異性強(qiáng)

降低PCR反應(yīng)的要求，增強(qiáng)特異性

穩(wěn)定性好

-20℃一年以上，反復(fù)凍融不影響活性。適用范圍大規(guī)?；驒z測(cè)目的基因拷貝數(shù)極低的樣本

GC含量高,有二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板復(fù)雜基因組樣本PCRMasterMix產(chǎn)品特點(diǎn)PCR常見問題分析PCR常見問題無擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性擴(kuò)增或拖尾假陽性問題1：無擴(kuò)增產(chǎn)物現(xiàn)象：正對(duì)照有條帶，而樣品則無M樣品A樣品B正對(duì)照純度：含有抑制物濃度：含量低質(zhì)量：全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)：二級(jí)結(jié)構(gòu)

原因?qū)Σ呒兓０寤蛘呤褂脙?yōu)質(zhì)試劑盒提取模板DNA加大模板的用量用好的反轉(zhuǎn)錄酶用溫度高的反轉(zhuǎn)錄酶無擴(kuò)增產(chǎn)物之模板原因引物錯(cuò)誤引物設(shè)計(jì)不好引物降解引物合成、純化不好

原因?qū)Σ吆铣汕皺z查評(píng)價(jià)、重新設(shè)計(jì)引物換一管新引物免費(fèi)重新合成無擴(kuò)增產(chǎn)物之引物原因退火溫度延伸時(shí)間循環(huán)次數(shù)

原因?qū)Σ哌f度PCR聚合酶的延伸速度適當(dāng)增加循環(huán)數(shù)無擴(kuò)增產(chǎn)物之PCR條件原因現(xiàn)象：條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致或者非特異性擴(kuò)增帶問題2：非特異性擴(kuò)增M12引物特異性差模板或引物濃度過高酶量過多Mg2+濃度偏高退火溫度偏低循環(huán)次數(shù)過多

原因?qū)Σ咧匦略O(shè)計(jì)引物或者使用巢式PCR適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)減少酶量降低鎂離子濃度適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法減少循環(huán)次數(shù)非特異性擴(kuò)增靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

原因開管輕柔，防止形成氣溶膠；防止靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外更換試劑、耗材試劑分裝，貯存適當(dāng)。更換實(shí)驗(yàn)室和所有試劑耗材。問題3：假陽性現(xiàn)象：空白對(duì)照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)策提高PCR特異性的策略

巢式PCR（Nest-PCR）

遞減PCR（TouchDownPCR）

熱啟動(dòng)PCR（HotStartPCR）

使用PCR增強(qiáng)劑四種策略策略之一巢式PCR（Nest-PCR）P1P2P3P4增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度降低了擴(kuò)增多個(gè)靶位點(diǎn)的可能性提高困難PCR（如5‘RACE）特異性前幾個(gè)循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約5℃的退火溫度下開始，然后每個(gè)循環(huán)降低1-2℃,直到退火溫度低于Tm5℃。特異性最高的目的模板會(huì)被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢(shì)。遞減PCR對(duì)于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。策略之二遞減PCR（TouchDownPCR）

熱啟動(dòng)主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達(dá)到變性溫度通常選擇熱啟動(dòng)Taq酶熱啟動(dòng)PCR是除了好的引物設(shè)計(jì)之外，提高PCR特異性最重要的方法之一策略之三熱啟動(dòng)PCR甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等可能的機(jī)理：降低熔解溫度，有助于引物退火，輔助DNA聚合酶延伸通過二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng)

策略之四

使用PCR增強(qiáng)劑RT-PCR簡(jiǎn)介

主要內(nèi)容RT-PCR原理RT-PCR步驟常見問題分析兩步法RT-PCRmRNA5’3’AAAAAAAAPoly(A)*尾TTTTOligo(dT)SuperRnaseH-ReverseTranscriptaseTTTTAAAAAAAAmRNAcDNATTTTcDNA3’5’5’3’PCR擴(kuò)增……SuperRnaseH-ReverseTranscriptase3’5’TTTTcDNATTTTcDNA……PCR擴(kuò)增5’3’mRNAAAAAAAAAPoly(A)*尾3’5’3’5’一步法RT-PCR兩步法與一步法RT-PCR比較兩步法一步法引物OligodT，隨機(jī)引物，GSPGSP優(yōu)點(diǎn)PCR擴(kuò)增失敗時(shí)便于分析原因特異性和靈敏度高適用檢測(cè)多種目的基因半定量RT-PCR大量樣品分析定性分析基因的轉(zhuǎn)錄水平獲取目的基因合成cDNA探針RT-PCR主要用途逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇AMV：禽成髓細(xì)胞瘤病毒，逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶H活性。最適42℃，最新版本可達(dá)60℃（Bioflux公司）。MMLV：Moloney鼠白血病病毒，逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶H活性較弱。最適37℃，最新版本42℃（賽百盛）SuperRNaseH-ReverseTranscriptaseMMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH-突變體，它能將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，最適42℃。（Tiangen天根生化）RNaseH的作用水解RNA-DNA雜合鏈中的RNASuperRNaseH-ReverseTranscri