吡非尼酮對大鼠肝微粒體總酶及其同工酶活性的影響

吡非尼酮對大鼠肝微粒體總酶及其同工酶活性的影響

氨基丙烯酸酯是一種新型的抗肺藥物，其結構為5-甲基甲基二羥吡啶（1羥基）-二氟吡啶（5-meth-1-phenyl-2（1h）-吡啶）。它可以防止或逆轉纖維和疤痕形成，抑制類固醇的合成，減少各種細胞因子的產生，抑制纖維細胞的形成及其相應的細胞因子的作用。本品系首個批準用于治療特發(fā)性肺纖維化(Idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)的藥物,我國已作為一類新藥批準生產。筆者擬對吡非尼酮進行臨床前藥動學研究及對肝細胞色素P450酶(CYP)的影響,對該藥臨床應用的可行性提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1實驗動物及動物SPF級SD大鼠,體質量200~240g,雌雄兼有,購自武漢大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(鄂)2004-0004。1.2不安裝約束緩沖器2.吡非尼酮為上海睿星基因技術有限公司提供,含量>99%,酮康唑(西安楊森制藥有限公司,批號:010803649);醋酸地塞米松注射液(湖北天藥藥業(yè)股份有限公司,批號:030308),紅霉素、二甲基亞硝胺、6-磷酸葡萄糖二鈉、6磷酸葡萄糖脫氫酶、氧化型輔酶Ⅱ(NADP)均為Sigma公司產品,甲醛、乙酰丙酮、連二亞硫酸鈉等為國產分析純試劑,BCA試劑盒為上海碧云天生物技術有限公司生產。1.3酶標儀和超低溫冰箱elx低溫高速離心機(3-18K,Sigma公司);酶標儀(Elx800);超低溫冰箱(-86℃)(NCLAIR);721紫外-可見分光光度計(上海第三分析儀器廠)。1.4地塞米松、地康唑、吡非尼酮的藥酶使用SD大鼠共56只,分為7組,每組大鼠8只,雌雄各半。溶媒對照組[給予1%羧甲基纖維素鈉(sodiumcarboxylmethylcellulose,CMC-Na)10mL·kg-1];地塞米松藥酶誘導組(給予0.5%地塞米松100mg·kg-1);酮康唑藥酶抑制組(給予1%酮康唑40mg·kg-1);乙醇誘導組(給予50%乙醇5mL·kg-1);吡非尼酮低、中、高劑量組(給予吡非尼酮25,50,100mg·kg-1)。分別灌胃給藥6,12d后處死動物,取肝臟制備微粒體。1.5l-1氯化鈣溶液制備方法采用鈣沉淀法制備肝臟微粒體。肝臟組織勻漿后于2℃,10000×g離心15min,再取上清液與88mmol·L-1氯化鈣溶液混勻,冰浴5min。2℃,27000×g離心15min,棄上清液,微粒體沉淀以0.25mol·L-1蔗糖溶液重懸,-70℃保存?zhèn)溆谩?.7dasper1.0數(shù)據(jù)結果以均數(shù)±標準差(ue0af±s)表示,采用DASver1.0統(tǒng)計軟件進行正態(tài)性檢驗、方差分析和Q值檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結果2.1各組大鼠cyp含量比較結果見表1。CYP總酶方差分析見表2。組間兩兩比較見表3。從表1可見,給藥6d時,與溶媒對照組比較,地塞米松藥酶誘導組可使大鼠CYP含量增加(P<0.01),酮康唑藥酶抑制組可CYP含量減少(P<0.01)。吡非尼酮低劑量組CYP含量雖有增加,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),當吡非尼酮劑量增加至50mg·kg-1時則可明顯增加CYP含量,表現(xiàn)為劑量依賴性。2.2大鼠肝微粒體nda酶活性結果見表4。從表2可見,給藥6d時,中和高劑量吡非尼酮對大鼠肝微粒體NDMA酶活性無影響(P>0.05),乙醇誘導組NDMA酶活性有誘導作用(P<0.01)。給藥12d時,中和高劑量吡非尼酮對大鼠肝微粒體NDMA酶活性仍無影響。2.3吡非尼酮對大鼠肝微粒體erd酶活性的影響結果見表5。從表3可見,給藥6d時,地塞米松誘導組可使大鼠肝微粒體ERD酶活性增加(P<0.01),吡非尼酮中和高劑量組對大鼠肝微粒體ERD酶活性均有誘導作用(P<0.01),同時吡非尼酮高劑量組誘導作用高于吡非尼酮中劑量組。給藥12d時,各用藥組肝微粒體ERD酶活性進一步增加,吡非尼酮高劑量組誘導作用仍高于吡非尼酮中劑量組,表現(xiàn)出明顯的劑量和時間依賴性。3cyp活性的變化肝微粒體CYP的含量測定一般采用經連二亞硫酸鈉還原的肝微粒體懸浮液的一氧化碳(CO)差光譜計算。但是由于在標本收集時,很難用門靜脈灌洗,所以在制備微粒體時混有較多的血紅蛋白,在測定CYP的濃度時血紅蛋白-CO復合物可干擾還原型P450-CO復合物的吸收光譜。為此,本實驗用通CO微粒體懸浮液的連二亞硫酸鈉差光譜計算,可消除血紅蛋白對測定的干擾。CYP是藥物代謝酶系統(tǒng)中重要組成部分,參與藥物或毒物的代謝,有200多種化合物可誘導CYP的產生,在肝微粒體中使CYP含量增加,另一些藥物可抑制其活力,使肝微粒體中CYP產生減少。本實驗采用典型的CYP誘導劑地塞米松及抑制劑酮康唑進行實驗,分別出現(xiàn)明顯的CYP增加及減少效應,說明本實驗的方法是可行的,其結果有可比性。CYP3型酶與體內一些內源性和外源性化合物的代謝有關,并可被類固醇、大環(huán)內酯類抗生素、抗真菌藥物及苯巴比妥誘導。此亞型酶在體內占CYP總量70%,占肝內CYP30%。在人體內,目前已發(fā)現(xiàn)4種CYP3A基因,即CYP3A3,CYP3A4,CYP3A5和CYP3A7,其中CYP3A4是在肝內含量較高,是人體內鎮(zhèn)痛藥芬太尼氧化代謝的主要酶。紅霉素N-脫甲基酶是一種CYP同工酶,測定此酶主要反映CYP3A的活性。CYP2E1最早在兔肝微粒體中分離純化出來,其特征為能被乙醇誘導,并被命名為P450LM3a,迄今發(fā)現(xiàn)所有CYP2E1的底物在人和動物中都是相同的,因此研究動物的CYP2E1對人具有重要參考意義。本實驗通過測定NDMA酶活性來反映CYP2E1的活性。值得一提的是,大量的研究已證明,乙醇是一種典型的CYP2E1誘導劑。許多易揮發(fā)性麻醉劑的體內代謝都與CYP2E1有關(如氟甲氧氟烷、異丙氧氟烷、甲氧氟烷、二乙醚、三氯乙烯、三氧甲烷等);芳香族類化合物(如苯、對乙酰氨基酚、二甲基亞硝胺)的代謝也與CYP2E1有關。KHARASCH等研究發(fā)現(xiàn)此酶可被異煙肼等誘導。慢性乙醇中毒者可增強體內苯巴比妥、利福平等的代謝率,加快這些藥物的排泄速度,認為此作用可能與CYP2E1被誘導有關;相反,急性乙醇中毒者又可能因乙醇競爭與CYP2E1結合,從而減慢上述同類藥物的代謝速度。由于CYP2E1的活性存在個體和種族的差異,其底物主要是人們經常接觸的前致癌物和前毒物,因此鑒定更多由CYP2E1催化代謝的藥物和化學物質對于指導臨床合理用藥是必不可少的。從統(tǒng)計分析結果可以看出,吡非尼酮中劑量組、高劑量組和溶媒對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),并且隨著劑量的增加,CYP的含量也在增加;地塞米松和乙醇分別使藥酶的活性大大增強(P<0.01),吡非尼酮中、高劑量對CYP3A有顯著的誘導性(P<0.05),隨著時間的增加誘導作用也會增強,而對CYP2E1則無影響(P>0.05)。1.6amwelln-demethylae,ndames活性和甲基兩種酶活性CYP含量的測定采用差示分光光度法。二甲基亞硝胺N-脫