川楝子與肝臟cyp3a活性的相關(guān)性研究

川楝子與肝臟cyp3a活性的相關(guān)性研究

梓子是毛囊科植物的后代。川楝子首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。性味辛、甘、熱,有毒。具有回陽補(bǔ)火,溫中止痛、散寒除濕之功,被譽(yù)為“回陽救逆第一品藥”。其主要功效為補(bǔ)火助陽,鼓動陽氣以恢復(fù)臟腑氣機(jī)的升降出入、氣血津液的運(yùn)行敷布、經(jīng)絡(luò)氣血的流通灌注,從而維持人體正常生理的活動。由于川楝子毒性極強(qiáng),誤食或用藥不慎則可發(fā)生中毒。人類進(jìn)行藥物代謝的主要器官是肝臟。肝臟進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化則依賴于微粒體中的多種酶系,其中最重要的是細(xì)胞色素P450(CYP)混合功能氧化酶系統(tǒng)。由于該酶系廣泛分布于肝、腎、腦、皮膚、肺、胃腸道及胎盤等組織器官,因此由P450酶系催化的氧化還原反應(yīng)可發(fā)生在體內(nèi)許多部位。CYP參與90%以上藥物的代謝。其中,肝臟的CYP酶活性對口服藥物的代謝具有重要的意義。P4503A(CYP3A)是CYP酶系最主要的亞型之一。CYP3A占肝臟CYP總量的30%、占腸組織CYP總量的70%,參與50%以上口服藥物的I相代謝。目前研究發(fā)現(xiàn),大部分口服中藥可誘導(dǎo)或抑制CYP3A活性、蛋白及基因水平,從而影響其自身代謝并容易引起藥物間相互作用[2~6]。本實(shí)驗(yàn)就觀察川楝子與CYP3A相關(guān)性,了解川楝子體內(nèi)代謝是否與CYP3A相關(guān),為川楝子的臨床安全應(yīng)用提供參考。1材料和方法1.1動物中心模型ICR小鼠,雄性,體重(26±2)g,60只,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物中心,動傲物合格證號SCXK(京)2002~2003,在本室飼養(yǎng)3天后用于正式實(shí)驗(yàn)。2試驗(yàn)試劑和試劑川楝子水提物:由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室提供;酮康唑片(CYP3A的抑制劑酮康唑?yàn)殛栃詫φ账?:由昆明云健制藥有限公司提供;磷酸二氫鈉(批號:20050601)、磷酸氫二鈉(批號:20040506)、氯化鈉(批號:20070210)、DAB(批號:20000321)、聚乙二醇6000(批號:20051001)、考馬斯亮藍(lán)(批號:20030611)均由北京化學(xué)試劑公司提供。紅霉素(批號:20061022)、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)生成系統(tǒng)(包括4mmol/LNADP,10mmol/L6-磷酸葡萄糖二鈉,6-磷酸葡萄糖脫氫酶(XV,Sigma)4U/ml)、甲醛(批號:20050811)、醋酸(批號:20051026)、乙酸胺(批號:20061201)。3光光度計(jì)SHIMADZUUV-120-02紫外可見分光光度計(jì);德國JOUAN恒溫高速離心機(jī);北京醫(yī)療設(shè)備廠恒溫水浴箱;SHI-MADZUBl-220H電子天秤;江西醫(yī)療器械廠液體快速混勻器。4實(shí)驗(yàn)方法4.1動物組雄性ICR小鼠,按體重隨機(jī)分為正常對照組、正常加川楝子大、小劑量組,酮康唑組,每組15只。4.2灌胃酮康唑組川楝子兩個劑量組均灌胃相應(yīng)劑量的川楝子煎煮液(0.2ml/10g),酮康唑組灌胃酮康唑溶液(150mg/kg,0.2ml/10g),正常對照組灌胃等容量的生理鹽水。每天一次,連續(xù)14次。4.3測試指標(biāo)第14天動物禁食過夜,斷頭處死。迅速打開腹腔,取部分肝臟和小腸(近胃幽門處約20cm)組織制備微粒體檢測肝臟CYP3A活性。4.3.1磷酸緩沖液和勻漿器勻漿取肝臟和小腸組織,用預(yù)冷0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)沖洗后,用濾紙吸水分,稱重,1∶4比例加0.1mol/L磷酸緩沖液,用電勻漿器勻漿。在高速離心機(jī)上離心(9000r/min)15min后,取上清液加入終體積為8.5%的50%聚乙二醇溶液,10000r/min離心20min,沉淀部分用50%聚乙二醇溶液,10000r/min離心20min,棄去上清液,所得微粒體懸浮與含有30%甘油的0.1mol/L磷酸緩沖液中,分裝后-80℃保存。整個過程要在1~4℃低溫中進(jìn)行。4.3.2測定蛋白質(zhì)含量4.3.3紅樹莓原汁混施參照有關(guān)文獻(xiàn),用紅霉素脫甲基活性測定法進(jìn)行活性測定。取相當(dāng)于0.4mg微粒體蛋白的肝微粒體勻漿分別加入不同試管中,在每只試管中加入4mmol/L的NADPH0.05mL,0.01mol/L的磷酸緩沖液0.25ml,然后用蒸餾水定容至0.5ml;各試管中紅霉素的濃度都是0.4mmol/L。37℃溫孵20min,然后加入25%硫酸鋅溶液0.05ml,混勻。終止反應(yīng)后,離心,上清液中加入Nash試劑,50℃溫孵30min后,測溶液在420nm處的吸光度,計(jì)算CYP3A比活性。4.4統(tǒng)計(jì)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SAS8.2處理。5肝臟cyp3a活性與正常對照組相比,酮康唑組和川楝子大、小劑量組肝臟、小腸CYP3A活性降低,差異顯著(P<0.05);與酮康唑組相比,川楝子大、小劑量組肝臟、小腸CYP3A活性無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果見表1、表2。6被肝臟cyp3a代謝根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,初步認(rèn)為,(1)川楝子被肝臟CYP3A代謝同時可抑制其活性;(2)川楝子和酮康唑(CYP3A的抑制劑)對CYP3A的抑制作用趨勢一致。7川髂子及其類物及其抑制劑cyp3a現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),CYP3A是細(xì)胞色素P450酶系的重要亞型之一,參與50%以上口服藥物的代謝,可直接影響其底物、誘導(dǎo)劑或抑制劑的血藥濃度、生物利用度,從而決定藥物的療效和毒性。通過本實(shí)驗(yàn),初步發(fā)現(xiàn)CYP3A是川楝子體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶,川楝子可能是CYP3A的抑制劑,即川楝子水提物可明顯降低肝臟CYP3A活性(P<0.05)。一般而言,酶抑制作用可減慢自身代謝,從而提高血中藥物濃度和藥物的生物利用度,增強(qiáng)自身的藥效或產(chǎn)生其毒性;同時也抑制其他同時應(yīng)用的藥物代謝,增強(qiáng)其他藥物的療效或毒性。因此,酶抑制作用所致的代謝性藥物相互作用有著很重要的臨床意義。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可推測,一方面,由于CYP3A活性受到抑制,從而減少川楝子的代謝,增加了血中烏頭堿濃度和生物利用度,可能引起毒性反應(yīng);另一方面,川楝子可能與CYP3A的其他底物或抑制劑競爭CYP3A,從而導(dǎo)致其