酮康唑?qū)Υ笫蟾渭毎亩拘孕?yīng)

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酮康唑（kcz）是第一種可以口服的咪唑類抗真菌藥物。它可以抑制細菌膜的麥角醇的生物合成，影響細胞膜的滲透性，抑制細菌的生長。臨床應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)其可以導(dǎo)致藥物性肝炎的發(fā)生。動物實驗表明,KCZ可以導(dǎo)致血清ALT和LDH活力的升高。目前,KCZ肝損傷機制尚不清楚。本研究采用大鼠肝細胞體外原代培養(yǎng)模型,觀察KCZ染毒后大鼠肝細胞活力、胞內(nèi)LDH泄漏量以及巰基的變化,探討其可能的肝毒性機制。1細胞培養(yǎng)和量效關(guān)系1.1主要試劑KCZ原料藥(批號:041204)由南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司惠贈。Ⅳ型膠原酶、William’sE培養(yǎng)液、HEPES、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)購自美國Sigma公司。胎牛血清購自德國Leonorenstr公司。1.2動物雄性SD大鼠體重180~220g,(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供,動物合格證號:SCXK-(軍)-2002-001),常規(guī)條件飼養(yǎng),試驗前禁食12h。1.3肝細胞的分離肝細胞的分離參考Seglen的膠原酶灌流法(兩步灌流法),肝細胞混懸于William’sE培養(yǎng)液中),用體積分數(shù)為0.6%的苔盼藍1∶1染色,以0.5×106/ml接種于鋪被鼠尾膠原的25cm2培養(yǎng)瓶中,以0.2×106/ml接種于鋪被鼠尾膠原的96孔板中。培養(yǎng)48h后用于試驗。1.4染毒方式以0.05mol/L稀鹽酸為溶劑,在量效關(guān)系研究中,KCZ設(shè)56、75、94、113和188μmol/L5個組和溶劑對照組染毒時間4h。在時效關(guān)系研究中,KCZ以188μmol/L染毒,分別于染毒0、0.5、1、2和4h后進行檢測。1.5檢測指標1.5.1細胞活力的測定:采用噻唑蘭(MTT)比色法和中性紅(NR)染色測定細胞活力。MTT參照Mosmann方法,NR參照Borenfreund方法進行檢測。結(jié)果以與溶劑對照組比值的百分比表示。1.5.2LDH活力檢測:將培養(yǎng)液以300g×5min離心后,取上清,用全自動生化檢測儀進行測定。1.5.3總巰基(TSH)和非蛋白結(jié)合巰基(NPSH)的測定:參照文獻進行TSH和NPSH測定。PSH(蛋白結(jié)合巰基)=TSH-NPSH。結(jié)果以μmol/L表示。1.5.4原子力顯微鏡觀察:肝細胞預(yù)培養(yǎng)48h后,188μmol/L染毒4h,用不含血清的William’sE培養(yǎng)液蕩洗后進行細胞表面形態(tài)的成像觀測。1.6統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。應(yīng)用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析及相關(guān)性檢驗。2結(jié)果2.1檢測指標結(jié)果分析KCZ不同劑量染毒4h后,隨著劑量的升高,細胞活力和胞內(nèi)巰基逐漸減少,培養(yǎng)液中LDH活力升高(表1,2),各項檢測指標與染毒劑量之間存在一定的相關(guān)性(rMTT=0.857,rNR=0.863,rLDH=0.906,rTSH=0.899,rNPSH=0.946,rPSH=0.879,P均<0.01)。與溶劑對照比較,*P<0.05,**P<0.01;n=12。與溶劑對照比較,*P<0.05,**P<0.01;n=3。2.2ldh活力變化酮康唑在188μmol/L劑量下,隨著染毒時間的延長,細胞活力和胞內(nèi)巰基逐漸下降,培養(yǎng)液中LDH活力不斷升高(表3,4)。與溶劑對照比較,*P<0.05,**P<0.01;n=12。與溶劑對照比較,*P<0.05,**P<0.01;n=3。2.3核仁的組成,細胞間連接緊密正常大鼠肝細胞原代培養(yǎng)后,在原子力顯微鏡下呈多邊形,邊緣清晰,有立體感,細胞間連接緊密,胞核呈圓形,內(nèi)有單個或多個核仁。KCZ188μmol/L染毒4h后,細胞立體感下降,細胞間連接模糊,細胞表面出現(xiàn)大量的大皰和凹陷,胞核消失(圖1~2)。3kcz對大鼠細胞骨架功能的影響本研究發(fā)現(xiàn)酮康唑可引起原代培養(yǎng)肝細胞活力下降,細胞表面出現(xiàn)大皰和凹陷,胞內(nèi)LDH外漏,有明確的量效和時效關(guān)系。有文獻報道,酮康唑可能通過抑制細胞色素P450LDM(羊毛甾醇脫甲基酶)的活力,使膽固醇前體物質(zhì)羊毛脂甾醇和7-烯膽(甾)烷醇C-14位或C-4位的去甲基化過程受阻,導(dǎo)致哺乳動物細胞膜中重要成分——膽固醇缺乏,從而使細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變,膜的通透性增強,穩(wěn)定性下降,結(jié)合在膜上的酶活力出現(xiàn)異常,胞內(nèi)LDH外漏,細胞受損。本試驗中還觀察到KCZ能夠引起大鼠肝細胞內(nèi)巰基物質(zhì)明顯減少。細胞骨架功能結(jié)構(gòu)的改變是引起細胞表面大皰的最直接的原因,胞內(nèi)Ca2+質(zhì)量濃度升高和巰基減少是深層原因。巰基物質(zhì)的降低改變了Ca2+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中關(guān)鍵性-SH基團并抑制了Ca2+轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的功能,導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)改變,從而影響到細胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能,巰基物質(zhì)的減少也可使骨架蛋白形成二硫鍵復(fù)合物,直接破壞細胞骨架的正常結(jié)構(gòu)。游離巰基中的GSH對維持細胞內(nèi)膜系統(tǒng)的完整性、細胞骨架的有序性、RNA合成等具有重要作用,并對抗氧化劑對細胞的毒害作用。本試驗中游離巰基的顯著減少反映出GSH的耗竭和不足,結(jié)果使細胞對毒物更敏感。而蛋白巰基對酶功能起著決定性的