木本植物組織培養(yǎng)中的再生體系

木本植物組織培養(yǎng)中的再生體系

木本植物在經(jīng)濟(jì)、生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)中發(fā)揮著重要作用。其環(huán)境價(jià)值包括涵養(yǎng)水源、保育土壤、固碳制氧轉(zhuǎn)化太陽(yáng)能、凈化環(huán)境、防護(hù)林的環(huán)境、景觀游憩以及生物多樣性等是林木產(chǎn)出價(jià)值的13.3倍。特別是近年來(lái),能源的短缺和高價(jià)位,吸引了更多的科學(xué)家尋找可再生能源。木本植物這一可再生能源的重要原料,將展示出新的利用前景。但是由于木本植物通常自然的繁育周期長(zhǎng),而且自然生長(zhǎng)的植株繁育率低,因此,在一定程度上限制了更多優(yōu)良樹(shù)木的選育和利用。通過(guò)不定芽培養(yǎng)是一種快速的樹(shù)木組織培養(yǎng)方法,不僅可以保持優(yōu)良品種的特性,而且可以極大地縮短木本植物生長(zhǎng)周期,因此越來(lái)越受到林業(yè)科學(xué)家的重視。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中,植物誘導(dǎo)不定芽的途徑通常有2種:直接誘導(dǎo)途徑,即從外植體的細(xì)胞形成器官原基,然后發(fā)育成器官;通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)途徑,即先從外植體上形成愈傷組織,再在愈傷組織上產(chǎn)生不同的器官原基。雖然目前木本植物通過(guò)不定芽誘導(dǎo)的成功報(bào)道很多,但是可以開(kāi)發(fā)為可再生能源的野生樹(shù)種如烏桕、小桐子和秤錘樹(shù)等,獲得成功的并不多,特別是在已有木本植物組織培養(yǎng)成功誘導(dǎo)不定芽的體系中,通過(guò)外植體直接誘導(dǎo)出不定芽的報(bào)道并不多,因此,筆者試圖對(duì)近年來(lái)木本植物組織培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)的有益探索進(jìn)行總結(jié),下面分別從外植體、培養(yǎng)基組分、外源激素以及其他外源理化因子等方面進(jìn)行有關(guān)論述,試圖尋找木本植物組織培養(yǎng)中不定芽誘導(dǎo)的共同點(diǎn),期望對(duì)提高木本植物育種效率的生物技術(shù)育種研究提供參考。1不同樹(shù)種選擇的外植體的選擇外植體的選擇是離體培養(yǎng)的首要步驟之一?？晒┻x擇的外植體很多,木本植物的器官:根、莖、葉等都可以選作外植體,但筆者認(rèn)為葉片更適合作為外植體來(lái)誘導(dǎo)木本植物的不定芽。這是因?yàn)槿~片來(lái)源廣泛,可再生能力強(qiáng),取材時(shí)不會(huì)對(duì)母株造成傷害,所以對(duì)于一些瀕危樹(shù)種尤為適用;下面主要從以葉片為外植體的不定芽誘導(dǎo)研究進(jìn)行分述。1.1葉的性質(zhì)與分布一般選擇外植體大小在1cm左右。太大易污染;過(guò)小不容易被激素啟動(dòng)或啟動(dòng)后僅僅產(chǎn)生無(wú)效愈傷組織,而且葉片還非常容易褐化死亡。從筆者的經(jīng)驗(yàn)來(lái)看在能減少污染的前提下,最好是增大葉片的面積,大葉片可能更有利于不定芽再生。另外葉片刻傷方式對(duì)不定芽的誘導(dǎo)影響也很顯著,筆者在秤錘樹(shù)組織培養(yǎng)初步研究中發(fā)現(xiàn)沿中脈橫切效果要優(yōu)于去除葉邊緣的圓盤法,因?yàn)椴欢ㄑ看蠖喟l(fā)生于葉脈和葉基部。這與賈小明等在河北楊和新疆楊離體葉片誘導(dǎo)不定芽的研究結(jié)果類似。1.2對(duì)外源激素的添加外植體的幼化程度直接影響著組織培養(yǎng)的結(jié)果,而材料的幼化程度和植物的年齡和著生部位關(guān)系密切。一般來(lái)源幼年植物的外植體要比來(lái)源成年樹(shù)的外植體容易培養(yǎng)。筆者在對(duì)秤錘樹(shù)的再生體系研究中發(fā)現(xiàn)用幼嫩的倒2葉作為外植體和以倒3,4葉的葉片為外植體,添加相同的激素時(shí),幼嫩的倒2葉很容易脫分化,而倒3,4葉的葉片很難脫分化,對(duì)外源激素的添加幾乎沒(méi)有反應(yīng)。李慧等在銀白楊葉片不定芽再生影響因素的研究中,將試管苗從頂部到基部自上而下劃分為3部分:第1～3片葉記為A,第4～6片葉記為B,第7～10片葉記為C。選取無(wú)根苗不同位置的葉片,接種至培養(yǎng)基(MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.5%+瓊脂0.55%,pH5.8),A葉片開(kāi)始誘導(dǎo)出不定芽時(shí)間早,再生率最高,達(dá)95%,再生系數(shù)達(dá)20個(gè)/片;B葉片次之;而C葉片最少?？梢?jiàn),取材位置對(duì)葉片不定芽再生的影響是非常明顯的。2從添加鹽和酸堿系培養(yǎng)基的方法對(duì)醉魚草木及其他懸鈴木物質(zhì)進(jìn)行配置,有利于植株之間模擬MS、N6和M8是植物組織培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基,但木本植物不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基報(bào)道的較多是MS培養(yǎng)基和中鹽低氮的WPM培養(yǎng)基。基本培養(yǎng)基對(duì)植株再生體系的建立影響較大,如馬同富等在楊樹(shù)葉片高效離體再生系統(tǒng)的研究中以MS為基本培養(yǎng)基,附加6-BA1.0mg/L與NAA0.05mg/L搭配有利于不定芽的形成,而且培養(yǎng)基中添加0.1～0.2mg/L赤霉酸(GA3)還可以提高其不定芽的發(fā)生頻率,到達(dá)92%。而何曉蘭等在懸鈴木葉片不定芽再生的研究中分別比較了WPM和MS基本培養(yǎng)基,結(jié)果表明在WPM基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的無(wú)菌苗葉色翠綠,健壯。而在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的無(wú)菌苗葉色淡黃,瘦弱。這與CieloCastillo在醉魚草不定芽誘導(dǎo)的研究結(jié)果相一致。筆者分析可能是由于MS培養(yǎng)基中的高鹽和高銨不利于植株不定芽的誘導(dǎo)。也有使用GD(Gresshoff&-Doy)為基本培養(yǎng)基的(具體配方見(jiàn)參考文獻(xiàn)),這種培養(yǎng)基較MS和WPM培養(yǎng)基相比,其特點(diǎn)是各種營(yíng)養(yǎng)成分明顯偏少,如賴明航等在馬尾松愈傷組織誘導(dǎo)條件的研究中以幼莖為外植體在含GD+6-BA4.0mg/L+NAA0.1mg/L+0.3%～0.4%活性碳(AC)+500mg/L水解酪蛋白的培養(yǎng)基上,愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)到93%。3影響因素配比影響木本植物不定芽誘導(dǎo)的因素包括基因型、外源激素、滲透壓、外植體來(lái)源、固化劑、培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分以及溫度、光周期和繼代時(shí)間等多個(gè)方面,其中外源激素的種類、質(zhì)量濃度和配比是最主要的因素之一。因植物體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為胚性細(xì)胞的一個(gè)重要前提是這些細(xì)胞必須脫離整體的束縛而進(jìn)行離體培養(yǎng),并有相應(yīng)的激素來(lái)誘導(dǎo)其細(xì)胞分化。但在離體條件下,細(xì)胞開(kāi)始時(shí)往往缺乏合成生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的能力,因此需要在培養(yǎng)基中添加不同種類或不同質(zhì)量濃度的外源激素以實(shí)現(xiàn)胚胎的誘導(dǎo)。完成胚胎的誘導(dǎo)以及隨后的不定芽再生所遵循的途徑有2條:直接途徑和間接途徑,前者常發(fā)生在不定芽形成的早期階段,而后者多發(fā)生于生長(zhǎng)后期,發(fā)生方式可以從不定芽基部是否有愈傷來(lái)判斷,不同的誘導(dǎo)方式所需的激素種類也不同。3.1不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的復(fù)合細(xì)胞分裂素對(duì)木本植物基承載力的影響直接誘導(dǎo)不定芽途徑是一條不經(jīng)過(guò)愈傷組織脫分化而直接誘導(dǎo)出不定芽的途徑,其優(yōu)點(diǎn)是再生的植株不會(huì)產(chǎn)生變異,能夠保持親本的優(yōu)良性狀。在離體細(xì)胞直接分化為不定芽的途徑中,植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑起著明顯的調(diào)節(jié)作用,其中的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比值直接影響著根和芽的分化,在一定范圍內(nèi),當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素質(zhì)量濃度的比值高時(shí),有利于芽器官的建成,當(dāng)兩者比值低時(shí),有利于生根。在銀白楊葉片不定芽再生的研究中表明:銀白楊葉片不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基是MS附加6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)(5∶1)(即MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖2.5%+瓊脂0.55%,pH5.8),不定芽再生率95%以上;當(dāng)6-BA/NAA<5時(shí),葉片不定芽再生率和再生系數(shù)均降低,當(dāng)5mg/L≤6-BA/NAA≤30mg/L時(shí),隨著比值的增大,不定芽再生率明顯下降;但李玉鈴等在澳洲青萍離體葉片不定芽再生體系的研究中,以6-BA和NAA為激素組合,最大的芽再生率為91.7%(MS+6-BA4.0mg/L+NAA0.2mg/L),最小僅為5%(MS+6-BA10.0mg/L+NAA0.5mg/L)盡管所用細(xì)胞分裂素同生長(zhǎng)素質(zhì)量濃度比值相同,但不定芽再生率卻差異顯著,可見(jiàn)在一定范圍內(nèi),葉片不定芽再生率的高低不僅與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類組合及比值有關(guān),還與兩者各自的絕對(duì)質(zhì)量濃度有關(guān)。在植物形態(tài)發(fā)生過(guò)程中,細(xì)胞分裂素能促進(jìn)分化和芽的形成,抑制根發(fā)育及衰老,因此找到一種強(qiáng)有力的細(xì)胞分裂素對(duì)于木本植物直接誘導(dǎo)不定芽來(lái)說(shuō)顯得尤為重要,噻苯隆(TDZ)是一種有效的新型細(xì)胞分裂素的類似物,其效果較6-BA至少高一個(gè)數(shù)量級(jí),使用質(zhì)量濃度通常在0.002～0.2mg/L范圍內(nèi),低質(zhì)量濃度時(shí)有利于誘導(dǎo)不定芽的增殖。如對(duì)河北楊和新疆楊離體葉片誘導(dǎo)不定芽的研究結(jié)果表明,適合河北楊和新疆楊離體葉片不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為:1/2MS+6-BA0.25mg/L+TDZ0.01mg/L+IAA0.25mg/L。在此培養(yǎng)基中,葉片分化率河北楊可達(dá)70%,新疆楊可達(dá)52%;平均分化芽數(shù)河北楊為6.84個(gè),新疆楊為5.32個(gè)。單獨(dú)添加6-BA則不能誘導(dǎo)出不定芽的產(chǎn)生,似乎TDZ對(duì)于上述不定芽誘導(dǎo)和再生體系的建立是必要的。但有研究表明高質(zhì)量濃度的TDZ阻礙芽的伸長(zhǎng),促進(jìn)愈傷的形成。盡管在直接誘導(dǎo)不定芽的研究中,總是以細(xì)胞分裂素為主,而生長(zhǎng)素的生理作用則表現(xiàn)出對(duì)抗細(xì)胞分裂素的效果,但在對(duì)灌木醉魚草類的研究中發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加6-BA9mg/L,誘導(dǎo)率可達(dá)53.3%,但添加生長(zhǎng)素類IBA1mg/L可顯著增加芽的誘導(dǎo)數(shù)量,誘導(dǎo)率達(dá)100%。這說(shuō)明在不定芽的誘導(dǎo)過(guò)程中,盡管生長(zhǎng)素類不一定是必須的,高質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素還會(huì)抑制芽的發(fā)生或誘導(dǎo)出愈傷組織,但當(dāng)細(xì)胞分裂素同低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素配合使用時(shí)會(huì)顯著誘導(dǎo)芽的發(fā)生。除了植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在直接誘導(dǎo)不定芽中起著顯著作用外,在諸如梨和蘋果等木本植物直接誘導(dǎo)不定芽的研究中,研究者還嘗試加入AgNO3,AgNO3作為乙烯合成的抑制劑,能夠抑制愈傷組織的形成,從而促進(jìn)不定芽直接從離體器官再生。如陳喜文等發(fā)現(xiàn),0.17mg/L的AgNO3可以顯著降低嘎拉蘋果葉片再生培養(yǎng)容器中的乙烯濃度,降低乙烯對(duì)不定芽分化的抑制作用,從而促進(jìn)不定芽的形成。3.2誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)通過(guò)愈傷誘導(dǎo)不定芽的間接途徑是先從外植體誘導(dǎo)出愈傷組織,再在愈傷組織上分化出不同的器官原基。在組織培養(yǎng)中最常見(jiàn)的分化器官是根和芽。大量的研究表明,幾乎所有高等植物的各種器官(如根、莖、葉和花等)以及各種組織(如皮層、莖髓和形成層等)離體后在適合條件下都能產(chǎn)生愈傷組織。愈傷組織誘導(dǎo)的成敗關(guān)鍵主要不是外植體的來(lái)源和種類,而是培養(yǎng)條件,其中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和質(zhì)量濃度最為重要。用于誘導(dǎo)愈傷組織的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可分為2大類,即生長(zhǎng)素類和細(xì)胞分裂素類,其中生長(zhǎng)素類有2,4-D、NAA、吲哚乙酸(IAA)等,細(xì)胞分裂素類有6-BA、KT、TDZ等。在眾多生長(zhǎng)素類中,以2,4-D誘導(dǎo)愈傷組織最為有效,隨著添加質(zhì)量濃度的不同,所得到的愈傷組織類型也有所不同。根據(jù)Armstrong標(biāo)準(zhǔn)可將所得到的愈傷組織分為3種類型:I型,結(jié)構(gòu)致密、復(fù)雜多樣、生長(zhǎng)緩慢,通過(guò)器官發(fā)生途徑分化芽和根,產(chǎn)生胚狀體較少,不易長(zhǎng)期繼代;Ⅱ型,結(jié)構(gòu)松散、易碎、呈顆粒狀、生長(zhǎng)較快,長(zhǎng)期繼代仍有胚性,能通過(guò)胚狀體途徑再生,2,4-D質(zhì)量濃度為5mg/L時(shí),形成的愈傷組織多為該類型;Ⅲ型,結(jié)構(gòu)粘軟、水浸狀、白色透明或半透明,容易繼代培養(yǎng),但幾乎喪失分化能力,為非胚性愈傷組織,2,4-D質(zhì)量濃度為8～10mg/L時(shí)形成的愈傷組織多為此類。盡管較高質(zhì)量濃度的2,4-D有利于胚性愈傷組織的誘導(dǎo),但一方面高質(zhì)量濃度的2,4-D使整個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)比例始終處于高比例的生長(zhǎng)素類似物狀態(tài),從而不利于隨后進(jìn)行的愈傷組織分化再生芽的過(guò)程,另一方面研究者認(rèn)為2,4-D對(duì)外植體及愈傷組織的傷害作用較大,故誘導(dǎo)時(shí)所采用的質(zhì)量濃度不宜過(guò)大,以減少組織培養(yǎng)中的無(wú)性系變異。而其他生長(zhǎng)素類NAA和IAA對(duì)植物細(xì)胞的毒害作用較輕,產(chǎn)生的愈傷組織較易分化,使用范圍為0.001～10mg/L,但I(xiàn)AA誘導(dǎo)愈傷組織的效果比NAA稍差。所以愈傷組織誘導(dǎo)階段,在添加外源生長(zhǎng)素類時(shí)應(yīng)優(yōu)先考慮采用NAA、IAA,如兩者都不能完成愈傷組織誘導(dǎo)時(shí),再考慮采用2,4-D誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí),一般還需要添加一定量的細(xì)胞分裂素,這樣可以使得到的愈傷組織更具有胚性。添加的細(xì)胞分裂素類,通常會(huì)選擇KT和6-BA,兩者的作用各有特點(diǎn),6-BA能促進(jìn)細(xì)胞分裂,有利于愈傷組織的形態(tài)建成;KT對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率的影響不大,但在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加KT可以改善愈傷組織的質(zhì)量,在一定程度上能延緩愈傷組織的衰老,延緩其器官分化能力的喪失,從而提高植株再生頻率。如在小葉楊×黑楊雜種后代的花藥愈傷組織分化比較試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),使用6-BA分化芽多、芽密、成叢狀,但苗細(xì)高、瘦弱、木質(zhì)化差;而添加KT分化出的芽稀且少,往往長(zhǎng)成獨(dú)株苗,粗壯木質(zhì)化程度高。盡管大多數(shù)情況下需要將6-BA或KT與生長(zhǎng)素結(jié)合使用才能完成形態(tài)建成,但有時(shí)單獨(dú)添加細(xì)胞分裂素也可以實(shí)現(xiàn)愈傷組織的誘導(dǎo),如外源TDZ能誘導(dǎo)黃芩外植體幼莖、子葉柄和下胚軸產(chǎn)生愈傷組織,并且隨著培養(yǎng)基中TDZ質(zhì)量濃度的增加,愈傷組織誘導(dǎo)率不斷增加。通過(guò)添加6-BA和TDZ,也可以完成對(duì)檳榔的愈傷組織誘導(dǎo)。一般而言,高質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素和低質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和增殖,通過(guò)誘導(dǎo)出的愈傷組織的生長(zhǎng)速度和類型來(lái)判斷所施加的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是否合理,從而作出相應(yīng)的調(diào)整,以得到具有分化潛力的胚性愈傷組織。3.3愈傷組織的分化在植物組織培養(yǎng)中,研究者大多關(guān)注外源激素的調(diào)節(jié),對(duì)內(nèi)源激素的作用很少涉及。實(shí)際上,植物組織培養(yǎng)的愈傷組織分化過(guò)程是內(nèi)源生長(zhǎng)素含量逐步降低、細(xì)胞分裂素含量逐步升高的過(guò)程。有關(guān)木本植物愈傷組織培養(yǎng)中內(nèi)源激素培養(yǎng)的研究很少,但從草本植物可以得到一些信息。如NAA和6-BA可以誘導(dǎo)水稻花藥、幼胚和花穗來(lái)源的愈傷組織完成芽的形態(tài)分化,其愈傷出苗率與內(nèi)源生長(zhǎng)素存在負(fù)效應(yīng),而與內(nèi)源細(xì)胞分裂素存在正效應(yīng)。煙草中已分化出芽愈傷組織的內(nèi)源生長(zhǎng)素含量明顯低于未形成芽的愈傷組織。有研究表明,愈傷組織開(kāi)始分化之前卻需要較高的生長(zhǎng)素含量。如小麥中形態(tài)發(fā)生能力強(qiáng)的愈傷組織與形態(tài)發(fā)生能力弱的愈傷組織相比,惟一的區(qū)別是前者的生長(zhǎng)素含量較高。愈傷組織分化過(guò)程也是內(nèi)源生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素的比值逐漸降低的過(guò)程。如用TDZ誘導(dǎo)的拐芹愈傷組織在轉(zhuǎn)移到空白MS培養(yǎng)基上后,第20d的IAA/KT比值達(dá)到最低值,此時(shí)愈傷組織表面亦開(kāi)始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)。在誘導(dǎo)愈傷組織分化時(shí),需要添加較低質(zhì)量濃度的生長(zhǎng)素和較高質(zhì)量濃度的細(xì)胞分裂素,這是因?yàn)樯L(zhǎng)素NAA通過(guò)促進(jìn)玉米素的代謝而降低內(nèi)源細(xì)胞分裂素的含量,而細(xì)胞分裂素6-BA通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂素的合成而使其含量增加,從而維持了較高的內(nèi)源細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值,因此,了解木本植物內(nèi)源激素的狀況,也將有利于指導(dǎo)不定芽誘導(dǎo)中外源激素的施用,保證有效愈傷組織的形成。4暗培養(yǎng)對(duì)植物不斷誘導(dǎo)的效果光照是植物組織培養(yǎng)中十分重要的環(huán)境因子。不同波長(zhǎng)的光對(duì)再生體系的建立都有影響。關(guān)亞麗等將暗培養(yǎng)10d后的離體赤桉葉片移至光下,光照時(shí)間為16h/d,發(fā)現(xiàn)其不定芽的誘導(dǎo)率要高于全程光下培養(yǎng)的誘導(dǎo)率,但隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),不定芽誘導(dǎo)率會(huì)下降。劉麗麗等在新紅星蘋果離體培養(yǎng)中研究也發(fā)現(xiàn),將材料進(jìn)行20d暗培養(yǎng)后,再轉(zhuǎn)到光下培養(yǎng),其效果要顯著好于全程光下培養(yǎng),再生率分別為73.3%和0。盡管上述研究表明暗培養(yǎng)有利于不定芽的誘導(dǎo),但暗培養(yǎng)對(duì)植株再生影響的觀點(diǎn)還很有限且持有爭(zhēng)議,暗培養(yǎng)的好處可能是光會(huì)降解IAA,因此暗培養(yǎng)會(huì)保持生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素在器官建成過(guò)程中的最佳比例,暗處理也會(huì)刺激植物細(xì)胞脫分化而加速器官建成,縮短光周期,降低光強(qiáng)以及暗處理會(huì)使細(xì)胞壁變薄,減少細(xì)胞壁沉積,使激素更容易透過(guò)細(xì)胞壁,但對(duì)于間接誘導(dǎo)不定芽的途徑來(lái)說(shuō),暗培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng),葉片傷口部位的愈傷旺盛,葉片愈傷組織化嚴(yán)重,就會(huì)抑制芽的再生,形成不定芽的數(shù)量也很少。因此暗培養(yǎng)對(duì)植物不定芽的誘導(dǎo)十分重要。但對(duì)不同植物而言,其影響是不同的,所以沒(méi)有統(tǒng)一的暗培養(yǎng)時(shí)間。5完善植物基因型人才培養(yǎng)芽的增殖途徑即莖尖、帶有腋芽的莖段或初代培養(yǎng)的芽,在適宜的培養(yǎng)基上誘導(dǎo),可使腋芽不斷萌發(fā)、生長(zhǎng),形成叢生芽。然后將叢生芽分離切割,再增殖為叢生芽。如此循環(huán),以芽生芽,可達(dá)快繁目的。在植物組織培養(yǎng)中,以芽生芽的能力還取決于培養(yǎng)基的激素種類和質(zhì)量濃度,還有細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比例。為促進(jìn)叢生芽的形成,細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的比值要較大。但質(zhì)量濃度也不宜過(guò)高,否則不但器官分化能力下降,而且遺傳穩(wěn)定性下降。當(dāng)細(xì)胞分裂素水平較高時(shí),形成莖芽的數(shù)目可能較多,但每個(gè)莖芽的生長(zhǎng)受到抑制。因而在誘導(dǎo)生根之前,還要把它們轉(zhuǎn)移到細(xì)胞分裂素較低的培養(yǎng)基上,有時(shí)還要加入赤霉酸,以促進(jìn)莖的伸長(zhǎng),在生根之前有一個(gè)壯苗時(shí)期,壯苗后的植株莖桿粗大,葉片寬大,利于生根和增加成活率。6培養(yǎng)基組成對(duì)愈傷組織褐變的影響外植體接種到培養(yǎng)基上時(shí)很容易出現(xiàn)褐變現(xiàn)象,其原因是完整的植物細(xì)胞中,酚類化合物和多酚氧化酶是分開(kāi)存在的,切割外植體后酚類化合物和多酚氧化酶流出,酚類化合物被多酚氧化酶氧化成褐色的醌類化合物,導(dǎo)致一系列的脫水、聚合反應(yīng),最后形成黑褐色物質(zhì),從而引發(fā)褐變:一般說(shuō)來(lái)木本植物較草本植物易引起褐變,但是培養(yǎng)的部位以及各種條件等也是影響褐變的重要原因。(1)就外植體的生理狀態(tài)而言:通常幼齡部位產(chǎn)生褐變輕,隨著組織老化褐變加重;(2)就培養(yǎng)基的組成而言:固體還是液體培養(yǎng)基,無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù),激素種類和質(zhì)量濃度,培養(yǎng)基的pH值,都影響著褐變的程度。研究表明液體培養(yǎng)基能有效防止褐變,降低無(wú)機(jī)鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù),尤其是Cu2+和Mn2+的質(zhì)量分?jǐn)?shù),可以減少酚類物質(zhì)外溢,外植體褐變減輕。培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素不僅促進(jìn)酚類化合物的合成還刺激多酚氧化酶的活性。相反生長(zhǎng)素類物質(zhì)能延緩多酚合成,減輕褐變。但對(duì)于活性很強(qiáng)的生長(zhǎng)素類物質(zhì)2,4-D來(lái)說(shuō),高質(zhì)量濃度的2,4-D卻是促使愈傷組織褐化的一個(gè)因素。研究表明:與不加任何激素的MS培養(yǎng)基相比,單獨(dú)添加2,4-D時(shí),IAA氧化酶和細(xì)胞分裂素氧化酶的活性明顯降低,從而影響愈傷組織的正常生長(zhǎng)和分化,這可能是導(dǎo)致愈傷組織褐化的重要原因。培養(yǎng)基中低的pH值有利于外植體減輕褐變;(3)就光照而言,光照能促進(jìn)植物組織中酚的氧化,加快外植體褐變;(4)就外植體大小而言,一般材料太小容易產(chǎn)生褐變;(5)就外植體組織受傷程度而言,在切割材料時(shí)應(yīng)盡量減少傷口面積,創(chuàng)傷面要平整;(6)還有材料轉(zhuǎn)移時(shí)間以及用于外植體滅菌的化學(xué)藥品等均可不同程度引起褐變的發(fā)生。針對(duì)上述情況,研究者從選擇合適的外植體,暗培養(yǎng),縮短連續(xù)轉(zhuǎn)移的周期以及加入抗氧化劑Vc和活性炭等措施加以克服,取得了良好的效果。7培養(yǎng)環(huán)境水勢(shì)玻璃化是試管苗的莖和葉成透明水漬狀,生長(zhǎng)畸形,難以誘導(dǎo)生根。玻璃苗的共同特點(diǎn)是植株矮小腫脹,呈半透明狀;莖短而粗,幾乎無(wú)節(jié)間葉片皺縮并縱向卷縮。玻璃化有可能與培養(yǎng)環(huán)境水勢(shì)不當(dāng),通