利用根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化大豆的研究

利用根癌農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化大豆的研究

大豆是重要的糧食、肥料和飼料。它是植物蛋白的主要來(lái)源，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)中發(fā)揮著非常重要的作用。轉(zhuǎn)基因大豆的研究也因此受到普遍重視。農(nóng)桿菌作為一種自然的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng),具有操作方便、費(fèi)用低廉、可插人外源基因片段大、不易發(fā)生重排、拷貝數(shù)低且符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律等優(yōu)點(diǎn),因而備受科研工作者的重視。農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化大豆的首例報(bào)道是由Hinchee等在1988年所作的,之后的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆方面的報(bào)道大多以Hinchee的工作為基礎(chǔ)。Meurer等報(bào)道了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)的影響因素,發(fā)現(xiàn)用超聲處理過(guò)的子葉節(jié)較對(duì)照容易轉(zhuǎn)化,而且農(nóng)桿菌菌株KYRT1的轉(zhuǎn)化效果最佳。最近也相繼有報(bào)道KYRT1在介導(dǎo)大豆轉(zhuǎn)化方面可以明顯提高轉(zhuǎn)化效率。Olhoft等相繼報(bào)道了在培養(yǎng)基中添加硫醇類化合物和L-半胱氨酸可以防止由農(nóng)桿菌侵染而導(dǎo)致的組織壞死現(xiàn)象,從而提高轉(zhuǎn)化頻率,同時(shí)采用潮霉素作為篩選劑應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆的遺傳轉(zhuǎn)化,也獲得了很好的效果。我們實(shí)驗(yàn)室以卡那霉素為篩選劑,采用EHA105建立的胚尖轉(zhuǎn)化體系也獲得了較高的轉(zhuǎn)化頻率。Paz等最近建立了一種“半種(half-seed)”系統(tǒng)使得大豆的轉(zhuǎn)化簡(jiǎn)單化,而且轉(zhuǎn)化效率有了明顯的提高。從以上的報(bào)告可以看出目前農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法采用的受體系統(tǒng)多數(shù)為子葉節(jié)。本研究采用大豆成熟種子胚尖作為轉(zhuǎn)基因受體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)基因植株,并對(duì)一些影響大豆轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了探討。在建立優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上,用含有cryIA(c)和pta(Pinelliatenataagglutinin)基因的雙價(jià)抗蟲(chóng)基因?qū)Υ蠖惯M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。1材料和方法1.1大豆種子的處理大豆[Glycinemax(L.)Merr]成熟種子品種有合豐35,合豐39,合豐25,東農(nóng)42,樂(lè)豐39,黑農(nóng)37和黑農(nóng)40。取表面光滑無(wú)病斑的大豆成熟種子,放入含有由30%NaClO+20%鹽酸反應(yīng)生成的氯氣的密閉容器中,6-8h后取出放至無(wú)菌水中28℃浸泡24h。去掉種皮,將下胚軸連同剛萌動(dòng)的胚尖與兩片子葉剝離,去掉原葉。1.2ambi-3300本研究中用到的農(nóng)桿菌菌株為琥珀堿型的KYRT1,章魚(yú)堿型的LBA4404和農(nóng)桿堿型的E-HA105。其中KYRT1菌株由美國(guó)肯塔基大學(xué)的Collins教授提供,雙價(jià)抗蟲(chóng)載體質(zhì)粒pCAMBIA3300由上海交通大學(xué)武天龍教授惠贈(zèng)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化過(guò)程中采用的雙元載體質(zhì)粒為pCAMBIA3301,該質(zhì)粒帶有CaMV35S啟動(dòng)的β-葡萄糖苷酶(gus)基因(帶內(nèi)含子)和CaMV35S啟動(dòng)的除草劑抗性(bar)基因。另一個(gè)雙價(jià)抗蟲(chóng)載體質(zhì)粒為pCAMBI-A3300,該質(zhì)粒帶有CaMV35S啟動(dòng)的除草劑抗性(bar)基因,CaMV35S啟動(dòng)的半夏凝集素(pta)基因和Ubiquitin啟動(dòng)的cryIA(c)基因(圖1)。參考Hofgen和Willmitzel的凍融法直接將質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株中。1.3乙酰丁香酮a挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于含卡那霉素100mg/L或者利福平100mg/L的5mlYEP液體培養(yǎng)基中,28℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜,然后將菌液轉(zhuǎn)至50ml新鮮的上述YEP液體培養(yǎng)基中搖至A600=1.4-1.6,菌體于4000rpm離心10min后重懸于感染液中[1/2MSB5(1/2MS基本培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽濃度,附加B5培養(yǎng)基的有機(jī)元素),30g/L蔗糖,10g/L葡萄糖,6.0mg/LBA,0.5g/LMES,200μmol/L乙酰丁香酮,A600調(diào)整至0.5]。胚尖在預(yù)培養(yǎng)基(MSB5+3.5mg/LBA+0.6%瓊脂)上光照培養(yǎng)24h后,在上述農(nóng)桿菌感染液中28℃振蕩培養(yǎng)20h,然后轉(zhuǎn)至共培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分同感染液,附加0.6%瓊脂)暗培養(yǎng)5天,用無(wú)菌水洗凈胚尖后轉(zhuǎn)至恢復(fù)培養(yǎng)基上(1/2MSB5+0.2mg/LBA+0.2mg/LIBA+300mg/L頭孢霉素),光照培養(yǎng)5-7天。恢復(fù)培養(yǎng)后的胚尖先后轉(zhuǎn)至含有0.5、0.75和1.0mg/LPPT的篩選培養(yǎng)基上(1/2MSB5+0.2mg/LBA+0.2mg/LIBA+300mg/L頭孢霉素),每輪培養(yǎng)3-4周,每10天繼代一次。當(dāng)抗性芽長(zhǎng)至3cm左右時(shí)將其切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基(1/2MSB5+1.0mg/LIBA+250mg/L頭孢霉素+0.25mg/LPPT),根長(zhǎng)到足夠健壯時(shí)敞開(kāi)瓶口練苗2-3天,然后移入培養(yǎng)土中。幼苗長(zhǎng)出兩片新葉后,再移栽到溫室中生長(zhǎng)結(jié)實(shí)。1.4tri能力測(cè)定法按照J(rèn)efferson的方法,取共培養(yǎng)5d的胚尖,在篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)抗性胚尖,分別浸入到X-G1uc溶液(含1mmol/LX-Gluc,10mmol/LNa2EDTA,100mmol/LpH7.0的磷酸緩沖液,0.5mmol/L亞鐵氰化鉀,0.5mmol/L高鐵氰化鉀,0.1%(v/v)TritonX-100)中,37℃保溫過(guò)夜。洗滌后轉(zhuǎn)入75%和95%乙醇中脫色,觀察染色情況。1.5pcr擴(kuò)增碳質(zhì)細(xì)胞系統(tǒng)cdk基因,克隆抗體patki取人工氣候室中的抗性植株葉片,采用CTAB法提取總DNA用于檢測(cè)。PCR擴(kuò)增bar基因的引物為:P1:5′-GCACCATCGTCAACCACTAC-3′,P2:5′-TGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3′;擴(kuò)增pta基因的引物為:PXF:5′-ATGGCCTCCAAGCTCCTCCT-3′,PXR:5′-GCTTATTAATTCACCTTCTC-3′;擴(kuò)增cryIA(c)基因的引物為:BTF:5′-ATGGACAA-CAACCCAAACATC-3′,BTR:5′-TAGAATCAGGAC-CCCAGACAC-3′。每個(gè)反應(yīng)體積為50μL,其中含上下游引物各0.4!mol/L,4種dNTP各100!mol/L,10×buffer5μL,TaqDNA聚合酶2U,模板50ng,礦物油50μL。PCR反應(yīng)參數(shù):94℃預(yù)變性5min;然后94℃變性1min,58℃退火1min,72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。5-10μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離,觀察拍照。1.6pcr擴(kuò)增聚合酶pa取20-30!gCTAB法提取的高質(zhì)量總DNA經(jīng)HindⅢ或者SmaI完全消化后,在0.8%瓊脂糖凝膠電泳上分離。參照Sambrook等的方法將DNA轉(zhuǎn)至帶正電荷的尼龍膜上。探針為以pCAMBIA3300為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增的cryIA(c)基因片段(680bp)和pta基因片段(804bp)。采用隨機(jī)引物法(Takara試劑盒)用[α-32P]dCTP進(jìn)行標(biāo)記。預(yù)雜交、雜交和洗膜依次按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行(TOYOBO雜交試劑)。雜交膜壓X-光片,在-70℃放射自顯影3天。2結(jié)果2.1外植體的存活率本實(shí)驗(yàn)中所使用的篩選標(biāo)記基因是除草劑抗性基因bar,篩選劑為PPT。在轉(zhuǎn)化之前,首先對(duì)各種不同的外植體的PPT篩選濃度進(jìn)行確定。把經(jīng)過(guò)24h預(yù)培養(yǎng)的胚尖和由胚尖分化的芽苗接種在含有不同濃度的PPT的芽分化培養(yǎng)基上。選擇三種基因型進(jìn)行測(cè)定,四周后統(tǒng)計(jì)外植體存活的數(shù)目,計(jì)算存活率,結(jié)果表明在含有PPT的培養(yǎng)基上,各外植體的生長(zhǎng)明顯受到了抑制,并逐漸褐化死亡。相對(duì)而言芽苗較為敏感,在PPT濃度為0.75mg/L時(shí),它的存活率僅為2%左右。在PPT濃度為1.0mg/L時(shí)幾乎所有的胚尖都死亡,而在濃度為0.5mg/L時(shí)雖然存活率為8%左右,但是存活的胚尖基本上都不能正常的產(chǎn)生芽苗。有研究表明在大豆子葉節(jié)系統(tǒng)中不同的大豆品種對(duì)選擇劑的敏感性存在著一定差異,但是本試驗(yàn)結(jié)果顯示基因型間同種外植體對(duì)PPT的敏感性沒(méi)有顯著差異。而且我們所采用的胚尖系統(tǒng)對(duì)PPT的敏感性較強(qiáng),這將有利于提高轉(zhuǎn)化效率以及非嵌合轉(zhuǎn)化體的高效再生。在轉(zhuǎn)化篩選過(guò)程中以這個(gè)PPT濃度(胚尖為0.75mg/L,芽苗為0.5mg/L)為基礎(chǔ)進(jìn)行選擇。2.2eha105的gus表達(dá)大量研究表明,農(nóng)桿菌對(duì)不同植物的侵染能力存在著很大差異,不同植物對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性也明顯不同。因此,在遺傳轉(zhuǎn)化研究中兩者的匹配選擇十分重要,即選擇農(nóng)桿菌與植物之間有著高侵染力的配合直接影響著轉(zhuǎn)化效率。本研究中,分別屬于3種不同染色體背景的農(nóng)桿菌菌株KYRT1,LBA4404,EHA105被用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。將攜帶有同一質(zhì)粒pCAMBIA3301的三個(gè)農(nóng)桿菌對(duì)三種優(yōu)良大豆品系的胚尖進(jìn)行轉(zhuǎn)化,共培養(yǎng)5天后進(jìn)行GUS染色,計(jì)算瞬時(shí)表達(dá)率。從GUS瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果(表1,圖版Ⅰ,圖A)來(lái)看:三種菌株對(duì)大豆胚尖均具有較強(qiáng)的侵染能力。但是相較而言KYRT1是LBA4404的轉(zhuǎn)化效率的1.6倍左右,同時(shí)由于應(yīng)用LBA4404為轉(zhuǎn)化載體時(shí)較難操作,培養(yǎng)過(guò)程中易結(jié)球,共培養(yǎng)后較難除菌,影響了抗性苗的獲得,因此首先排除LBA4404。而對(duì)于KYRT1和EHA105這兩種超毒菌株而言,差別并不是很顯著,但是使用KYRT1獲得了最高的GUS瞬時(shí)表達(dá)頻率(69.3%),另一方面進(jìn)一步的研究表明KYRT1侵染后獲得的抗性芽數(shù)目是EHA105的1.4倍左右。因而在隨后的實(shí)驗(yàn)中,我們使用KYRT1作為轉(zhuǎn)化用的菌株。各菌株對(duì)供試的3個(gè)大豆品種的侵染也表現(xiàn)出明顯的基因型差異。三個(gè)受試品種對(duì)同一菌株的敏感程度依次是合豐35〉合豐25〉東農(nóng)42。2.3培養(yǎng)條件:農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的最共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH對(duì)瞬時(shí)表達(dá)率的影響在不同的轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中有不同的結(jié)果。有研究認(rèn)為較低pH對(duì)轉(zhuǎn)化有利,原因是偏酸性的培養(yǎng)條件有利于農(nóng)桿菌vir區(qū)基因的表達(dá)。也有人認(rèn)為pH7.0對(duì)轉(zhuǎn)化有利,原因是pH7.0有利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng),可縮短共培養(yǎng)時(shí)間,減輕農(nóng)桿菌對(duì)植物材料的毒害,從而有利于轉(zhuǎn)化材料生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),共培養(yǎng)基中pH為5.4時(shí),胚尖具有最高的抗性芽得率(44.8%,圖2)。當(dāng)pH低于5.2或者高于5.6時(shí)抗性芽得率顯著下降。2.4共培養(yǎng)溫度和溫度對(duì)農(nóng)桿菌gus表達(dá)的影響共培養(yǎng)的溫度對(duì)T-DNA的轉(zhuǎn)移也有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)探討了共培養(yǎng)溫度對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆的影響。大豆幼嫩的胚尖經(jīng)農(nóng)桿菌感染后分別在19℃,22℃,25℃,28℃四種溫度下共培養(yǎng)5d后,檢測(cè)其GUS瞬時(shí)表達(dá)及相應(yīng)的抗性芽得率。結(jié)果顯示(圖3),22℃共培養(yǎng)溫度條件下農(nóng)桿菌具有最高的侵染活性,95%的胚尖均具有GUS活性,而且也獲得了最高的產(chǎn)生抗性芽頻率(59.8%)。當(dāng)溫度低于22℃時(shí),抗性芽的數(shù)目大大下降,19℃時(shí)抗性芽得率比22℃時(shí)下降了近50%。當(dāng)溫度高于22℃時(shí),抗性芽的數(shù)目也隨著溫度的升高而下降,28℃時(shí)的抗性芽得率與19℃時(shí)的基本一樣,即最低的抗性芽得率。這說(shuō)明T-DNA的轉(zhuǎn)移對(duì)溫度是很敏感的。2.5共培養(yǎng)后先進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)篩選方式對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響較大。為確定有利于轉(zhuǎn)化細(xì)胞存活和分化生長(zhǎng)的最佳條件,我們?cè)囼?yàn)了不同篩選方法對(duì)轉(zhuǎn)化后大豆再生頻率的影響。共培養(yǎng)之后外植體的生長(zhǎng)能力較弱,如果直接轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上會(huì)造成已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因?yàn)樯L(zhǎng)能力變?nèi)醵鴮?dǎo)致對(duì)抗生素抗性變?nèi)醵劳?。本?shí)驗(yàn)中我們也采取了共培養(yǎng)之后先進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)的方式,這也是目前大豆遺傳轉(zhuǎn)化中逐漸趨向統(tǒng)一的一種方式。感染過(guò)的胚尖經(jīng)過(guò)5-7天的恢復(fù)培養(yǎng)后,再進(jìn)行高選擇壓的篩選培養(yǎng),這樣獲得的抗性胚尖比未進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)的要多,但是抗性胚尖上剛剛萌動(dòng)的分化芽大部分不能耐受高濃度的選擇壓力而逐漸褐化死亡。而效果更佳的篩選方式是將感染過(guò)的胚尖經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)后,先進(jìn)行低濃度選擇壓的篩選培養(yǎng),再進(jìn)行高選擇壓的篩選培養(yǎng),這種方式獲得的抗性胚尖及其分化頻率均較高。雖然恢復(fù)培養(yǎng)的同時(shí)可能會(huì)造成非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的大量增殖,抑制轉(zhuǎn)化細(xì)胞的增長(zhǎng)或是造成假陽(yáng)性和嵌合體,但長(zhǎng)時(shí)間的高濃度選擇壓下的篩選培養(yǎng),可以淘汰大量的非轉(zhuǎn)化體而得到較多的轉(zhuǎn)化植株。因此實(shí)驗(yàn)中篩選方式選用后者。2.6大豆基因型對(duì)農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的影響我們已經(jīng)研究了影響大豆遺傳轉(zhuǎn)化的幾個(gè)因素,將這些優(yōu)化的條件組合起來(lái)形成了優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系。大豆胚尖經(jīng)農(nóng)桿菌感染、共培養(yǎng)和恢復(fù)培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng),抗性組織轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并分化出芽苗(圖版Ⅰ,圖C,D)并具有GUS的穩(wěn)定表達(dá)(圖版Ⅰ,圖B),當(dāng)芽長(zhǎng)至3cm左右后將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進(jìn)一步發(fā)育,形成較好的根系(圖版Ⅰ,圖F),進(jìn)而抗性小植株被移栽到溫室的花盆中(圖版Ⅰ,圖G),最終得到假定的轉(zhuǎn)基因植株(putativetransgenicplants)。用這個(gè)優(yōu)化的轉(zhuǎn)化體系,供試的7個(gè)大豆優(yōu)良品系均得到了抗性植株,轉(zhuǎn)化頻率(PCR陽(yáng)性植株率)為4.29%-18.0%(表2)。差不多所有的假定的轉(zhuǎn)化植株形態(tài)正常并且大多數(shù)(約70%)能夠正常結(jié)實(shí)(圖版Ⅰ,圖H)。植物基因型的依賴性是目前公認(rèn)的影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的主要限制因素。大豆基因型對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性,以及農(nóng)桿菌對(duì)大豆的侵染能力直接影響到大豆的遺傳轉(zhuǎn)化效率,是備受關(guān)注的問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同基因型對(duì)根癌農(nóng)桿菌侵染的敏感性存在著顯著的差異。其中樂(lè)豐具有最高的轉(zhuǎn)化率18.0%;其次合豐系列(25,35和39)和東農(nóng)42也獲得了較高的轉(zhuǎn)化率;而黑農(nóng)37和黑農(nóng)43對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性最差,他們的轉(zhuǎn)化效率最低。另外實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌對(duì)取得最高轉(zhuǎn)化率的樂(lè)豐39的侵染能力并沒(méi)有合豐39高,但是前者的植株再生能力很強(qiáng),組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中由樂(lè)豐39的胚尖產(chǎn)生的芽苗數(shù)目為3-5個(gè),由健康的芽苗再生成小植株的頻率達(dá)到95%,而且移栽成活率也最高。因此一個(gè)高效的組織培養(yǎng)再生體系對(duì)于后期的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)中我們所取得的較高的轉(zhuǎn)化效率也歸功于所采用的高效的胚尖再生體系。2.7轉(zhuǎn)化植株葉片的分析提取PPT抗性植株的DNA,進(jìn)行bar基因、pta基因和cryIA(c)基因的PCR分析。結(jié)果表明隨機(jī)抽取的30個(gè)植株中有24株為陽(yáng)性植株,陽(yáng)性植株中三個(gè)被測(cè)基因均有表達(dá),未出現(xiàn)單株差異現(xiàn)象。PCR陽(yáng)性植株率約為80%。PCR檢測(cè)結(jié)果初步證明外源基因已經(jīng)整合進(jìn)大豆基因組中。部分抗性植株的PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4。PCR陰性植株的產(chǎn)生可能是由于未被轉(zhuǎn)化的芽苗在抗性培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)或者是轉(zhuǎn)入的外源基因沒(méi)有能夠穩(wěn)定地整合進(jìn)大豆的基因組中。在對(duì)這些轉(zhuǎn)化植株葉片進(jìn)行PPT抗性分析之前,我們首先用棉棒將濃度為0、100、200、400、600mg/L的PPT溶液涂抹未轉(zhuǎn)化植株葉片。1-2周后發(fā)現(xiàn),當(dāng)PPT濃度為200或200mg/L以上時(shí),所有經(jīng)過(guò)涂抹的大豆葉片均在一周內(nèi)開(kāi)始黃化,脫水萎蔫,直至枯死。因而確定200mg/L的PPT溶液為適宜用量。所有這些PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株葉片經(jīng)200mg/L的PPT溶液涂抹后,均表現(xiàn)出對(duì)PPT的抗性(圖版Ⅰ,圖E)。這些結(jié)果證實(shí)了bar基因已經(jīng)整合進(jìn)大豆基因組并得到了表達(dá)。PCR檢測(cè)bar基因、pta基因和cryIA(c)基因均為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化植株被用來(lái)進(jìn)一步做Southern雜交分析。用CTAB法提取基因組DNA,用HindⅢ酶切后以PCR擴(kuò)增的pta基因片段為探針進(jìn)行Southern印跡分析,同時(shí)用SmaI酶切后以PCR擴(kuò)增的cryIA(c)基因片段為探針進(jìn)行Southern印跡分析。HindⅢ和SmaI在pCAMBIA3300質(zhì)粒中雖均為雙酶切位點(diǎn),但是按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的程序依舊可以說(shuō)明Southern雜交條帶的數(shù)目基本可以顯示外源基因整合位點(diǎn)的數(shù)目。由圖5可看出,未轉(zhuǎn)化植株未顯示任何雜交信號(hào),而檢測(cè)的10個(gè)轉(zhuǎn)化植株中有6個(gè)都顯示了pta基因和cryIA(c)基因的雜交信號(hào),證明這兩個(gè)外源基因已經(jīng)整合進(jìn)大豆基因組中。其中有4個(gè)顯示單一條帶,2個(gè)顯示2條帶,表明外源基因在植物基因組中大多數(shù)(66.7%)為單位點(diǎn)整合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物外源基因拷貝數(shù)低的優(yōu)點(diǎn)。3對(duì)農(nóng)桿菌誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的作用與其他雙子葉農(nóng)桿菌宿主植物(如煙草、馬鈴薯等)比較,大豆的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化難得多,是公認(rèn)的難轉(zhuǎn)化植物。究其原因,我們認(rèn)為大豆農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的主要障礙有兩個(gè)方面:一是大豆對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性差。Hinchee等從100多個(gè)基因型中只篩選到了3個(gè)轉(zhuǎn)化頻率較高的材料。超毒菌株EHA105在大豆轉(zhuǎn)化中已被廣泛使用。最近KYRT1也被證明可以有效提高轉(zhuǎn)化效率。本實(shí)驗(yàn)中我們對(duì)三種不同染色體背景的大豆常用農(nóng)桿菌菌株進(jìn)行了測(cè)試,篩選得到大豆胚尖最為敏感的KYRT1菌株,有效地提高了轉(zhuǎn)化效率。應(yīng)試的7個(gè)大豆品種中除了黑農(nóng)系列以外其他5個(gè)品系均獲得了較高的轉(zhuǎn)化率(12.31%-18%)。其次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)胚尖再生系統(tǒng)可以承受更長(zhǎng)的感染時(shí)間(20h),其原因大致如下:(1)外植體表面光滑,比較容易洗去農(nóng)桿菌,而子葉節(jié)表面不光滑,褶皺較多,農(nóng)桿菌不易被洗去;(2)胚尖外植體有較強(qiáng)的分生能力,其分生組織為原分生組織,具有很強(qiáng)的分生能力,感染后其生長(zhǎng)能夠抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng),從而明顯降低了壞死的可能性。這樣長(zhǎng)時(shí)間的侵染也在一定程度上提高了大豆對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性。二是缺少適合于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的大豆再生體系。實(shí)驗(yàn)中我們采用的胚尖再生體系相對(duì)較常用的大豆子葉節(jié)再生體系具有較高的再生頻率,而且單個(gè)外植體獲得多芽的頻率也較高。而就再生周期來(lái)看,胚尖再生體系具有更短的周期,能在較短的時(shí)間內(nèi)獲得更多的再生植株。因此這一高效的再生體系的使用是轉(zhuǎn)化水平提高的基礎(chǔ)。同時(shí)篩選方式的優(yōu)化也有助于外源基因的整合并得到較多的