新月外源基因導入研究進展

新月外源基因導入研究進展

玫瑰是世界上最重要的觀賞植物之一。月季育種的目標主要集中在對花色、花香、花形、開花習性、鮮切花壽命、株型、抗病性等的改良上,在花卉育種中更受關注。由于月季基因資源有限、缺乏純系以及由倍性和染色體數(shù)目差異造成的高度不親和性,因而傳統(tǒng)的方法存在著一定的局限性?；蚬こ碳夹g因能保持品種其它性狀的相對穩(wěn)定,只在外源基因所控制的性狀上發(fā)生改變,并能利用來自其它生物類型的基因,從而為月季品種改良提供了新途徑。而通過體細胞進行月季組織培養(yǎng)和建立遺傳轉化體系是基因工程育種的重要基礎工作。本文就近年來在這方面的研究進展進行綜合回顧,為月季基因工程改良研究提供參考。1植株再生過程為了進行基因轉化、突變育種、快速繁殖和品種保存,必須建立植株的再生系統(tǒng)。1967年Hill首次報道月季的組培再生器官研究,隨后又有多篇論文報道:在‘Soraya’、‘Baccara’等品種上實現(xiàn)了通過體細胞胚狀體發(fā)生和器官發(fā)生途徑再生完整植株直至開花。Rout等對國外近年來月季生物技術的研究成果進行了概述,但相關報道在國內極少見到。植株的再生一般經(jīng)歷從愈傷誘導、愈傷分化(體細胞胚狀體發(fā)生或器官發(fā)生)、胚狀體成熟萌發(fā)或芽的發(fā)育、到植株再生、完整植株的移植等步驟。下面將從影響植株快繁、愈傷誘導、體細胞胚狀體和器官發(fā)生、植株再生等方面闡述月季的組織培養(yǎng)研究進展。1.1培養(yǎng)基的性質對小芽增殖的影響以往月季的繁殖方式主要靠嫁接、扦插和壓條等,繁殖系數(shù)低,遠遠滿足不了市場的需要。1970年,Elliott首次在聚花月季(Rosamultiflora)上成功地進行了芽的繁殖和誘導幼苗生根。1976年,Zieslin等報道細胞分裂素有利于提高叢生芽的數(shù)量,但也增加了誘發(fā)花器官敗育或退化的頻率。而Bressan研究發(fā)現(xiàn),采用6-BA質量濃度為0.03～0.3mg/L的MS培養(yǎng)基時可促進“GoldGlow”側芽的發(fā)育,但當BA質量濃度超過0.3mg/L則顯著推遲芽萌發(fā),畢艷娟也報道了低濃度的細胞分裂素(BA、ZT)有利于提高月季的萌芽率。不同種類的細胞分裂素對月季莖增殖的影響也不同。Marcelis等在添加相同濃度(0.44μmol·L-1)的細胞分裂素BA、ZTKT、ZR、2iP、ipA研究結果表明,KT實際上對莖增殖沒有多少影響;而BA、ZT、ZR都可顯著促進莖的重量和長度增加;2iP和ipA雖也可促進莖的形成,但效果不如BA、ZT、ZR的明顯。細胞分裂素配合一定的生長素可共同促進月季側芽的萌發(fā)與生長,最常用的是NAA。在6-BA質量濃度相同的情況下,隨NAA質量濃度的升高(0.05～0.20mg/L)月季小芽生長速度加快。但NAA用量同時會影響芽增殖速度,當NAA用量達0.1mg/L以上時,芽增殖的速度有下降趨勢。培養(yǎng)基中添加蔗糖有增加叢芽數(shù)量的作用,加入低濃度的GA3能進一步改善芽繁殖,95%的外植體能產(chǎn)生7個以上的小芽。移植植株生長均一,保留母本的優(yōu)良性狀。Martin等調查了2125個無菌苗3年間在大田生長的情況,沒有發(fā)現(xiàn)變異植株,說明通過側芽方式繁殖的植株性狀很穩(wěn)定。1.2生長素種類及濃度對愈傷產(chǎn)生能力的影響1967年Hill最早報道從雜交茶香月季(R.hybridcv.Tearose)的莖上誘導了愈傷組織,但實驗結果只到芽原基(shootprimordial)。該實驗證明在培養(yǎng)基中添加2,4-D或添加NAA和激動素(kinetin,Kin)均能很快誘導出愈傷組織。Lloyd等曾研究R.persica×xanthina、R.hybridacv.‘Clarissa’、R.hybridacv.‘DameofSark’和R.rugosacv.‘Scabrosa’的愈傷發(fā)生能力,發(fā)現(xiàn)只有R.persica×xanthina的節(jié)間能產(chǎn)生愈傷,愈傷組織脆性,呈淡黃綠色,該實驗是以MS為基本培養(yǎng)基,添加低濃度的BAP和NAA。表明月季愈傷組織的誘導與其品種的基因型有關。激素、糖和外植體類型也是影響愈傷生成的重要因素。Rout等以‘Landora’為材料,在添加BA和NAA、2,4-D的MS培養(yǎng)基上,葉外植體在接種7～12d后,在近軸面的葉柄和中脈處產(chǎn)生愈傷,愈傷組織誘導頻率高達92%;莖外植體在接種15～20d,切端處產(chǎn)生愈傷,頻率為76%。生長素種類和濃度對愈傷產(chǎn)生能力的影響同樣很大。早期實驗多采用NAA結合BAP或BA等,近年來多采用2,4-D,2,4-D對愈傷的誘導效果因月季的基因型不同而異,如2,4-D濃度從11.3μmol/L增加到181μmol/L,降低了R.hybrida栽培種“CarefreeBeauty”的愈傷誘導頻率,但該濃度則對另一個品種“GrandGala”無影響。VanderSalm等證明2,4-D對誘導R.persica×xanthina和‘Moneyway’產(chǎn)生愈傷是非常必要的,進一步添加低濃度的BAP有正效應,但如果BAP濃度過高,則產(chǎn)生抑制作用。表明2,4-D是誘導愈傷組織的必要因素。1.3細胞胚發(fā)誘導成功的體細胞胚狀體發(fā)生體系的建立將有助于月季的試管苗快繁、冷藏保存、人工種子的生產(chǎn)和基因的轉化操作等等。1987年Valles和Boxus首次從體細胞胚狀體得到再生植株。多年的研究證明體細胞胚狀體的發(fā)生是月季微繁殖潛在的非常有效的方法。體細胞胚再生的基本培養(yǎng)基有MS、1/2MS、B5、SH等。培養(yǎng)基中的微量元素若除去Mg2+、Zn2+、I-或是降低三者的濃度或是提高Cu2+濃度10倍,有利于愈傷形成和體細胞胚誘導。但是在體細胞胚發(fā)芽時,Cu2+濃度的提高對發(fā)芽不利。Murali等調查22個品種發(fā)現(xiàn),只有2個品種能進行體細胞胚狀體的發(fā)生誘導。deWit等也發(fā)現(xiàn)在供試的7個品種中,只有‘Domingo’和‘VictoryBrown’具有產(chǎn)生體細胞胚狀體的能力,表明月季的體細胞胚狀體發(fā)生能力與基因型的關系密切。因此,至今為止,還沒有一種單獨的方案可以誘導出多倍體月季基因型體細胞胚。Kintzios等認為,培養(yǎng)時的光照強度對體胚的形成影響很大,光強低于50μmol·m-2·s-1光照條件體胚的發(fā)生頻率最高。絕大多數(shù)進行體細胞胚的誘導實驗都是在培養(yǎng)基中添加細胞分裂素(BA、BAP、Zeatin或Kin)和生長素(2,4-D、NAA)。Kintzios等則證明在供試材料上使用NAA、BA和GA3對誘導產(chǎn)生體細胞胚狀體無效,CPA才是誘導體細胞胚狀體的決定因素。以上結果表明月季的體細胞胚狀體發(fā)生能力也因品種以及外植體的類型隨激素類型和濃度不同而有所變化。1.4分離芽的誘導月季的芽器官(shoot)發(fā)生表現(xiàn)為兩種類型:一類直接起源于外植體,不需經(jīng)過愈傷組織階段;而另一類需要經(jīng)歷愈傷階段的過程。1967年,Hill首次報道從愈傷組織再生了芽原基,但最終未能得到真正的芽,以后Tweddle等和Llody等分別報道R.persica×xanthina的愈傷組織在含BA和NAA的MS培養(yǎng)基中能再生不定芽,Arene等證明在MS培養(yǎng)基中添加BAP也能誘導愈傷組織分化芽。而Rosu等則以增殖的無菌叢生芽為外植體,在含BA和NAA的培養(yǎng)基上直接再生了芽,當這些不定芽移至含NAA、GA3和硝酸銀的培養(yǎng)基中,能誘導出叢生芽。另外,Ishioka和Tanimoto證明,在MS培養(yǎng)基中只添加硝酸銨,70%的外植體產(chǎn)生不定芽。Rout等報道GA3和adeninesulfate加速了再生芽的產(chǎn)生。表明以莖為外植體可能更適合于進行芽器官再生的誘導。1.5植株的變異一般無菌苗移植到室外的成活率達80%以上。通過芽快繁途徑得到的植株或不經(jīng)愈傷階段直接起源于葉、根的植株,生長情況與對照相同,無變異發(fā)生。相反,來源于營養(yǎng)器官的愈傷組織再生的植株存在著21.7%的變異,外植體若為合子胚的,再生植株的變異率高達70%,變異性狀體現(xiàn)在花瓣的數(shù)量、形狀和顏色以及植株的生長高度上。VanderSalm等對13個再生植株的研究,發(fā)現(xiàn)其中12株的倍性與對照一致都是二倍體,但其中有1株的葉色變?yōu)榍逗仙?六倍體變異率為1/13。表明由營養(yǎng)器官愈傷組織再生得到的植株大多有變異現(xiàn)象。2胚性愈傷組織的基因結構及轉化高效的植株再生體系是遺傳轉化成功與否的重要前提條件。目前,已有許多月季品種通過器官發(fā)生和體細胞胚發(fā)生途徑成功地獲得再生植株,但關于月季遺傳轉化的報道還不多,除VanderSalm等采用不定根作為轉化受體外,其它所有轉化系統(tǒng)都采用了胚性愈傷組織或體細胞胚[30.31]進行轉化。1991年Firoozababy等首次成功地進行了農(nóng)桿菌介導的月季轉化。他們以R.hybridacv.Royalty為供試材料,將其胚性愈傷與含有pnosNPTⅡ/p35SLUC質粒的致瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404或與含有pnosNPTⅡ/p35SGUS質粒的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenesis)15834共培養(yǎng),得到了很高轉化愈傷頻率,即每克愈傷約產(chǎn)生40～60個獨立的抗卡那霉素愈傷,通過LUC或GUS和PCR技術檢測,幾乎100%的抗性愈傷為轉化體。次級體細胞胚和胚性愈傷組織因能長期保存,不斷提供豐富的材料,而且再生能力持久,成為目前主要的受體材料,之后通過抗性體細胞胚或胚性愈傷組織的再生獲得轉化植株。唯一例外的是VanderSalm等采用R.hybridacv.Moneyway節(jié)間組織與農(nóng)桿菌在誘根培養(yǎng)基上共培養(yǎng),得到轉化的不定根,再經(jīng)12個月從轉化的不定根上誘導出胚狀體,最終長成植株。農(nóng)桿菌菌株及質粒種類對轉化影響不大,根癌農(nóng)桿菌LBA4404或發(fā)根農(nóng)桿菌15834的轉化效率無顯著差異,根癌農(nóng)桿菌GV3101、EHA105和GV2260也都有成功報道,但農(nóng)桿菌的預培養(yǎng)及共培養(yǎng)時間對轉化效率有一定影響。Dohm等報道使用根癌農(nóng)桿菌EHA105和GV2260時,搖菌時間不應超過2h,共培養(yǎng)時間分別為2d和6d。共培養(yǎng)的結果得到再生的轉基因植株。2004年,Kim等將綠色熒光蛋白基因運用農(nóng)桿菌介導法成功轉化月季,并得到Southern雜交分析驗證。以上結果表明農(nóng)桿菌菌株及質粒種類對轉化影響不大,但農(nóng)桿菌的預培養(yǎng)及共培養(yǎng)時間對轉化效率有一定影響。除農(nóng)桿菌介導法外,基因槍法也被應用于月季的轉化。影響月季基因槍法遺傳轉化的因素有:發(fā)放距離(終止屏和目標組織之間的距離)、裂盤壓力、調節(jié)滲透壓的滲透物質以及滲透物加入的時間等。Marchant等研究指出當發(fā)放距離為70mm時,GUS檢測達到最高,而當發(fā)放距離大于100mm時未檢測到GUS表達。當裂盤壓力為9000kPa時GUS表達最高。3種滲透物質肌醇、山梨醇(含甘露醇)、蔗糖的比較表明,于EP培養(yǎng)基中加肌醇0.25mol/L,GUS表達量高于轟擊后48h加2倍的肌醇。在轟擊前4h加肌醇和轟擊后24h加肌醇最有利于基因的轉入。Marchant等指出轉入的片段整合到月季基因組的位置對轉基因植株基因表達的影響比轉入片段數(shù)目的影響更重要。Marchant等以胚性愈傷組織細胞為對象,通過轉化GUS報告基因,將基因槍法的轉化條件進行了優(yōu)化。同年,Marchant等利用基因槍法成功地將幾丁質酶基因導入月季,減少黑斑病發(fā)生率13%～43%。利用基因槍法成功轉化月季關鍵是攜帶DNA的微粒有效穿入目標組織。月季遺傳轉化中PEG介導法也廣泛應用。影響PEG介導法的因素有原生質體分離所用的復合物、植物材料來源和基因型、細胞懸浮預培養(yǎng)條件、外源DNA等。Schum等研究了影響月季原生質體分離和轉基因植株再生的因素,結果表明1.5%纖維溶素,0.5%粗制纖維素酶和0.5%解析酶的復合物,分離不同月季基因型離體培養(yǎng)的芽和愈傷組織、非胚發(fā)生和胚發(fā)生的懸浮培養(yǎng)細胞中的原生質體效率最高,原生質體的產(chǎn)量很大程度上取決于材料來源和基因型,從葉肉提取原生質體可降低體細胞自身變異對基因轉化的影響。多數(shù)情況下,非胚及胚發(fā)生的細胞懸浮培養(yǎng)物是分離原生質體的優(yōu)選材料。特殊的預培養(yǎng)條件,如培養(yǎng)基中生長素的類型,懸浮生長周期中的合適階段,材料培育中的光照條件,都是成活的原生質體獲得高且一致的萌發(fā)率所不可缺少的。3對轉化條件的優(yōu)化月