獼猴桃酒中的葉綠素及護色研究

獼猴桃酒中的葉綠素及護色研究摘要:綠色是果蔬及其部分制品的重要商品性狀，本文通過對葉綠素的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性的分析，以楊凌“秦美”獼猴桃為原料，對獼猴桃酒的護綠進行工藝優(yōu)化，研究護綠劑、發(fā)酵溫度、貯藏溫度、光照條件對護綠效果的影響。分別測定葉綠素、類胡蘿卜素的含量，結(jié)合感官評定選出較佳的護綠組合。關(guān)鍵詞:葉綠素；護綠；獼猴桃酒果蔬的色澤是構(gòu)成產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素,也是檢驗果蔬成熟衰老的依據(jù),色澤不僅反映果蔬的新鮮度,還可促進人們的食欲,美麗天然的食品顏色是優(yōu)質(zhì)果蔬的一個重要特征。果蔬的綠色主要來源于葉綠素,葉綠素決定了產(chǎn)品的品質(zhì)特征,同時還具有改善便秘、降低膽固醇、抗突變等生理功能。而葉綠素在果蔬貯藏、加工和貨架期極易褪色或者變色,嚴(yán)重影響了產(chǎn)品質(zhì)量,同時也大大降低了商品價值。獼猴桃是少有的幾種成熟后還保持綠色的果實之一，在其制品中綠色是一個重要的商品性狀，保持綠色就能提高其商品性狀。1.葉綠素1.1葉綠素的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)圖1葉綠素分子結(jié)構(gòu)及其模型葉綠素是高等植物進行光合作用的重要物質(zhì)，結(jié)構(gòu)為一個鎂和四個吡咯環(huán)上的氮結(jié)合以卟啉為骨架的綠色色素的總稱[1]。早在1818年，Berzelius就開始了對葉綠素的研究[2]。1933年美國以有機溶劑法為基礎(chǔ)，開始工業(yè)生產(chǎn)葉綠素，此方法延用至今[3]。圖1是葉綠素a的結(jié)構(gòu)和模型。主要有葉綠素a和葉綠素b兩種,在一些藻類中還有葉綠素c和葉綠素d。葉綠素是脂溶性色素,不溶于水,可溶于丙酮、乙醇和石油醚等有機溶劑,在顏色上,葉綠素a呈藍(lán)綠色,葉綠素b呈黃綠色,它們的含量之比約為3∶1。葉綠素a和葉綠素b及衍生物的吸收光譜表明,它們在紅光區(qū)(620~700nm)和藍(lán)紫區(qū)(400~500nm)出現(xiàn)了較深的黑帶,也就是說,這些光線被葉綠素強烈吸收;而在綠光區(qū)(520~580nm)沒有黑帶,即未被吸收,這也正是葉綠素是綠素的原因。戴榮繼等人[4]采用紫外檢測器和二極管陣列的三維檢測器多次嘗試后,最終確定葉綠素a的發(fā)射波長為433nm,激發(fā)波長為664nm;葉綠素b的發(fā)射波長為469nm,激發(fā)波長為670nm。1.2葉綠素的功能應(yīng)用食品行業(yè)中用來分析葉綠素衍生物添加劑的含量以及食品的色澤。綠色食品近年來受到了人們廣泛關(guān)注，而存在于綠色植物中的一種獨特而重要的營養(yǎng)物質(zhì)—葉綠素，它的一些生理功能也開始備受重視。葉綠素的結(jié)構(gòu)和血紅素極相似，易于被人體吸收，有賦活細(xì)胞的作用，在醫(yī)藥、食品和日化工業(yè)中有廣泛用途，由于葉綠素為天然品，無毒副作用，長期食用安全、可靠，因此，F(xiàn)AO/WHO對葉綠素每人日允許攝入量未作規(guī)定。目前，葉綠素已廣泛應(yīng)用于口香糖、硬糖、果汁、瓊脂、糕點等食品（但不能用于酸性或含鈣食品，否則，易產(chǎn)生沉淀），日本已將其作為綠色色素用在食品添加劑中醫(yī)藥工業(yè)上葉綠素具有改善便秘、降低膽固醇、抗衰老、排毒消炎、脫臭、抗癌抗突變、抗貧血、保肝等功能，對皮膚組織有再生作用，可用于治療燙傷，慢性潰瘍，能抑制葡萄球菌和鏈球菌生長，對齒齦炎、口臭、中耳炎等有一定療效。另外，葉綠素可以防治感冒，感冒患者可將葉綠素溶液內(nèi)服涂口唇或含漱，每日數(shù)次，1～2d后癥狀可減輕。以葉綠素為原料研制治療缺鐵性貧血的葉綠素鐵鈉鹽，提高白血球水平的葉綠素鈷鈉鹽，增強智力和記憶力的葉綠素鋅鈉鹽具有重要價值，由葉綠素制得的葉綠素銅鈉鹽更是生產(chǎn)治療肝炎、胃病及十二脂腸潰瘍藥物的重要原料。葉綠素銅鈉鹽還是“肝寶”膠囊劑、“胃肝綠”片、“升血寶”、“胃康U”等藥物的重要有效成分。日化工業(yè)中用作制造香皂、香水、護膚霜、香波及牙膏等產(chǎn)品。因此，葉綠素的市場前景非常廣闊，而降低生產(chǎn)成本、簡化提取工藝、加強對葉綠素活性的一系列研究將對果蔬產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用、食品科學(xué)、醫(yī)藥保健等領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[5~7]。1.3影響葉綠素穩(wěn)定的因素果蔬中葉綠素的降解是其色澤退化的根本原因。影響葉綠素穩(wěn)定的因素有很多，比如光、葉綠素酶、溫度、pH、氧氣、微生物以及金屬離子等[8]。研究表明，光和氧氣對葉綠素的降解具有極顯著的影響，溫度、pH等對葉綠素降解影響也較顯著。1.3.1光光對葉綠素的降解機理，國內(nèi)外已有大量的研究。在活體植物中，葉綠素可以得到很好的保護，不僅不會發(fā)生降解，還可以進行光合作用。但離體的葉綠素在光的作用下變?yōu)槿€態(tài)，通過電子傳遞，產(chǎn)生自由基等活性氧而破壞蛋白質(zhì)、碳水化合物及DNA等生物分子的結(jié)構(gòu)，引起葉綠素分子的降解［9,10］。研究發(fā)現(xiàn)，紫堇葉綠素隨著光照時間的增加，其光吸收值降低，同時葉綠素的顏色逐漸變淺，當(dāng)光照時間大于4h時，紫堇葉綠素在430nm處的光吸收值明顯降低。唐小俊等[11]在室外自然光、室內(nèi)自然光和黑暗條件下對苦瓜葉綠素的光穩(wěn)定性進行了研究，結(jié)果表明，苦瓜葉綠素對光非常不穩(wěn)定，光越強，穩(wěn)定性越差。胡秋孌等[12]對薺菜葉綠素光穩(wěn)定性的研究和王敏等[13]對冬青葉綠素光穩(wěn)定性的研究都得出相似的結(jié)果。1.3.2氧氣在葉綠素的降解中占有重要地位，活性氧可使葉綠素四吡咯環(huán)碳環(huán)雙鍵裂解，導(dǎo)致卟啉大環(huán)裂解，同時O2還能影響相關(guān)酶的活性，對葉綠素的降解具有顯著性影響。許多文獻報道，葉綠素的降解速率與氧氣的濃度呈正相關(guān)，隨著環(huán)境中氧氣濃度的增加，葉綠素的褪色現(xiàn)象愈來愈嚴(yán)重。1.3.3溫度對葉綠素的降解具有顯著影響。研究表明，在不同受熱溫度條件下，葉綠素提取液的降解速率曲線有明顯的拐點。一般認(rèn)為，溫度影響葉綠素降解的機理主要是影響果蔬體內(nèi)各種酶的活性。如在青花菜中，葉綠素過氧化物酶的活性隨溫度的升高而升高，到達(dá)一定溫度時，葉綠素的含量迅速降低。1.3.4葉綠素在中性和弱酸弱堿性條件下較穩(wěn)定，研究表明，pH在6～11之間葉綠素的保存率高達(dá)90%。酸性過強會導(dǎo)致葉綠素脫鎂而褪色明顯，堿性過強則會加速脫酯反應(yīng)使葉綠素分解，但堿性條件下葉綠素不會發(fā)生脫鎂或碳環(huán)裂解反應(yīng)，能保持相對穩(wěn)定的色澤。1.3.5葉綠素酶大量研究證明，葉綠素酶在葉綠素酶促降解代謝的最初步驟中起作用，其最適反應(yīng)溫度為60～80℃，當(dāng)溫度大于80℃時，葉綠素酶活性下降，100℃時已完全失活。1.4護綠1.4.1降低體系的水分活度和貯藏溫度果蔬中的水分活度可以影響微生物的繁殖、代謝和生存。當(dāng)水分活度小于0.6時，果蔬在不需要冷藏的情況下可獲得較長的貨架期，色澤基本不變在低溫條件下，葉綠素酶的活性大大降低。研究表明，果蔬中葉綠素b的降解速度在40℃時比25℃時快3.2～5.2倍，比4℃時快11～21倍。通過真空冷凍干燥可以在低溫條件下降低果蔬中的水分活度使果蔬中的葉綠素得到最大限度的保留。1.4.2金屬離子取代鎂葉綠素分子卟啉環(huán)中的鎂離子在酸性條件下被氫離子取代，生成黃褐色的脫鎂葉綠素，但脫鎂葉綠素分子中的氫離子被銅、鋅、鈣等金屬離子取代，生成相應(yīng)的葉綠素金屬離子絡(luò)合物，恢復(fù)為綠色，這種絡(luò)合物對酸、熱、氧氣和光等的穩(wěn)定性大大提高，可使葉綠素較長時間的保存。同時，在果蔬加工過程中，配合熱燙處理，酸堿度調(diào)節(jié)等，可以達(dá)到很好的護綠效果。1.4.3染色技術(shù)葉綠素銅鈉、葉綠素鋅鈉等是葉綠素的衍生物作為安全的天然食品添加劑，具有很好的護綠效果葉綠素銅鈉呈藍(lán)黑或墨綠色，易溶于水，微溶于乙醇、氯仿，不溶于油脂，其耐光、耐熱性強于葉綠素有一定的吸濕性。葉綠素鋅鈉呈墨綠色，水溶性好難溶于丙酮和乙醇，耐熱性強，但耐光性較差，具有很好的抗氧化、還原性1.4.4其它護綠技術(shù)氣調(diào)貯藏是在一定的溫度和濕度條件下，通過控制貯藏環(huán)境中的氣體成分，延緩果蔬的生長勢，降低其呼吸強度，從而達(dá)到貯藏保鮮目的的貯藏方法。殼聚糖是一類涂膜保鮮劑，它可在果蔬表面形成半透膜，具有很好的護綠保鮮效果。盛瑋等用高壓脈沖電場處理果蔬，可以達(dá)到很好的護綠效果。其它護色技術(shù)還包括減壓貯藏、真空包裝或充氮包裝，利用蜂膠護色保鮮等。1.5葉綠素的檢測技術(shù)[14]葉綠素含量的測定方法主要有紫外分光光度法、熒光分析法、活體葉綠素儀法、原子吸收光譜法和光聲光譜法?？焖贉y定的方法包括基于計算機視覺技術(shù)的葉綠素含量檢測系統(tǒng)、快速檢測儀如SPAD-502葉綠素儀。其中分光光度法具有準(zhǔn)確度高的特點,是葉綠素含量測定過程中應(yīng)用最為廣泛的方法。因紫外分光光度法精確性高，所以GBT22182-2008油菜籽葉綠素含量測定就是使用的分光光度計法。紫外分光光度法測定葉綠素含量主要依據(jù)Arnon公式,其計算方法是:分別以提取溶劑作空白,測定葉綠素提取液吸光度A645、A663,根據(jù)下面的公式:Chla、Chlb、Chl和Car含量：紫外分光光度法測定。參照朱廣廉等的方法，略有改進。計算公式如下：Chla（mg/mL）=（12.7OD663－2.69OD645）×25V（1～1）Chlb（mg/mL）=（22.9OD645－4.67OD663）×25V（1～2）Chl（mg/mL）=20.2(OD645＋8.02OD663）×25V（1～3）=（1～4）25為測吸光度時的溶液體積，單位mL,V為所取獼猴桃酒樣的體積，單位mL。上述公式可以定量地說明葉綠素提取液受不同影響因子作用后的降解率。但是測試程序耗時，需要有經(jīng)驗的分析人員方能確保良好的數(shù)據(jù)及長期的一致性；且受多方面的因素影響。3.獼猴桃酒護綠工藝研究2.1獼猴桃酒加工工藝流程獼猴桃鮮果分選→清洗→去皮→破碎榨汁→酶解→下膠澄清→果汁成分調(diào)整→接種→避光發(fā)酵→獼猴桃發(fā)酵酒→澄清→貯藏→檢驗2.2獼猴桃果汁護綠劑的選擇獼猴桃清汁分別加入不同濃度的CuSO4、(CH3COO)2Zn、EDTA-2Na、CaCl2，在散光照射，室溫條件下，密封絕氧貯藏3d，測定葉綠素和類胡蘿卜素的含量。具體操作如下：（1）每試管20ml的獼猴桃清汁，向5支試管中分別加入CuSO4，比例為：0.625mg/L、1.25mg/L、1.875mg/L、2.5mg/L、3.125mg/L、5mg/L，3組平行；空白組：20ml的獼猴桃清汁。（2）每試管20ml的獼猴桃清汁，向5支試管中分別加入(CH3COO)2Zn，比例為：16.9mg/L、33.8mg/L、50.7mg/L、67.7mg/L、101.5mg/L、135.4mg/L，3組平行；空白組：20ml的獼猴桃清汁。（3）每試管20ml的獼猴桃清汁，向5支試管中分別加入EDTA-2Na，比例為：10mg/L、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L，3組平行；空白組：20ml的獼猴桃清汁。（4）每試管20ml的獼猴桃清汁，向5支試管中分別加入CaCl2138.75mg/L、277.5mg/L、555mg/L、1110mg/L、1665mg/L、2220mg/L，3組平行；空白組：20ml的獼猴桃清汁。2.3護綠劑的正交優(yōu)化每組選出三個獼猴桃清汁護綠效果較好的濃度，進行4因素3水平的L9（34）正交優(yōu)化，在散光照射、密封絕氧、室溫條件下靜置7d，測定葉綠素和類胡蘿卜素的含量。2.4獼猴桃酒發(fā)酵溫度的選擇調(diào)整好成分，加入復(fù)合護色劑的獼猴桃清汁，接入獼猴桃酒發(fā)酵菌種分別在15℃、20℃、25℃、30℃和自然條件下絕氧避光發(fā)酵。2.5獼猴桃酒貯藏溫度的選擇將15℃避光發(fā)酵的獼猴桃酒分別于0℃、5℃、10℃、25℃下絕氧避光貯藏1個月。2.6獼猴桃酒貯藏器具的選擇將15℃避光發(fā)酵的獼猴桃酒分別貯藏在透明玻璃瓶、棕色玻璃瓶、避光玻璃瓶中貯藏，貯藏溫度25℃。2.7獼猴桃酒的感官評定結(jié)合QB／T2027～94,按GBl5038～2005規(guī)定方法，略有改動，對獼猴桃酒進行感官品評，評定指標(biāo)見表2。表1獼猴桃酒感官評價Table1SensoryevaluationofKiwifruitliquor項目（Items）指標(biāo)(Index)分?jǐn)?shù)(Fraction)色澤(color)黃綠色，有光澤10外觀(fa?ade)澄清透明，無沉淀及懸浮物10香氣(smell)有秦美獼猴桃的果香及純正酒香40滋味(taste)口感協(xié)調(diào)、清新爽口、醇厚柔和、余味悠長30典型性(typical)有“秦美”獼猴桃酒的典型風(fēng)味103.結(jié)果分析3.1護綠劑的選擇對上述四個護綠劑每個因素取3個較佳護綠水平，因素水平表見表2所示：表2因素水平表Tab2Factorsandlevels序號因素A（CuSO4濃度/mg/L）B（(CH3COO)2Zn/mg/L）C（EDTA-2Na/mg/L）D（CaCl2/mg/L）11.25033.840111023.125101.560166535.000135.4802220由表3和表4并進行L9（34）數(shù)據(jù)分析如下：A、B、C、D4因素對獼猴桃清汁的護綠影響的主次順序為D＞B＞C＞A，從實際測定值差異顯著性分析可知，最優(yōu)組合為D3B2C1A3。榨出獼猴桃果汁后，加入護綠劑最佳濃度為：CaCl22220mg/L、(CH3COO)2Zn101.5mg/L、EDTA-2Na40mg/L、CuSO45mg/L。表3L9（34）正交試驗結(jié)果Table3L9（34）Orthogonaltest試樣號SampleNumber因素與水平Factorandlevel葉綠素Chl（mg/mL）護綠率（%）A(mg/L)B(mg/L)C(mg/L)D(mg/L)11(1.25)1(33.8)1(40)1(1110)0.737952.30212(101.5)2(60)2(1665)0.578641.01313(135.4)3(80)3(2220)0.703649.8742(3.125)1230.739752.42522310.805657.09623120.5740.4073(5)1320.656646.53832130.861461.05933210.520436.88K1143.18151.25153.75146.17K2149.91159.15130.31127.94K3144.46127.15153.49164.34k147.7350.4251.2548.72k249.9753.0543.4442.65k348.1542.3851.1654.78R1.8210.677.8112.13表4方差分析結(jié)果Tab4Resultsofvarianceanalysis方差來源離差平方和自由度方差F顯著性A1.25620.6288.814B13.65426.82795.818*C8.15224.07657.207*D15.12327.5615106.126**誤差0.28520.1425注：F0.05（2，2）＝19.00；F0.01（2，2）＝99.00*顯著**極顯著(Note：F0.05（2，2）＝19.00；F0.01（2，2）＝99.00)3.2溫度和貯藏容器的選擇表5酒樣感官評定Table5Samplewinesensoryevaluation酒樣（Sample）色澤（Color）澄清度（Clarity）果香（Fruit）酒香(wine)滋味(taste)典型性（typical）總分（100）15℃9.28.516.61420.28.57720℃8.88.615.714.419.88.275.525℃71.430℃8.58.713.613.818.87.570.49自然條件6.28.314.514.319.07.569.8對不同溫度發(fā)酵條件下的獼猴桃酒進行感官評定，具體結(jié)果見表5。由表5可知，酒1感官評分最高，色澤最好。對其余因素研究表明，護綠效果顯著的因素為：發(fā)酵溫度15℃，貯藏溫度0℃或5℃，透光率較低的黑色玻璃瓶。4.總結(jié)本文闡述了葉綠素的理化特性，變色機理以及防護措施；研究了不同護綠劑、發(fā)酵溫度、貯藏溫度、不同透光率的容器對獼猴桃酒護綠的影響，分別測定并比較了獼猴桃酒中葉綠素、類胡蘿卜素的含量，并將其含量與獼猴桃酒色澤相關(guān)聯(lián)，分析推測了獼猴桃酒護綠的較佳組合。主要結(jié)論如下：（1）最佳護綠劑濃度為：Ca2+（CaCl2）800mg/L、Zn2+（醋酸鋅）30mg/L、EDTA-2Na40mg/L、Cu2+(硫酸銅)2mg/L。（2）護綠效果顯著的因素為：發(fā)酵溫度15℃，貯藏溫度0℃或5℃，透光率較低的黑色玻璃瓶。（3）光照對獼猴桃酒制品的護綠效果影響最顯著。（4）在15℃下釀制的獼猴桃酒感官評價最好。參考文獻[1]布坎南B,格魯依森姆W,瓊斯RL.植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,2004:466