人用單克隆抗體質量控制技術指導原則

人用單克隆抗體質量控制技術指導原則03月20日公布

本要點合用于供治療的體內診療用的運用雜交瘤技術制備的單克隆抗體，合用于在人體內應用的運用重復DNA技術制備的基因工程抗體。

一、雜交瘤技術制備的單克隆抗體

（一）雜交瘤細胞

1．親本細胞

（1）骨髓瘤細胞

SP2/0或其它適宜的骨髓瘤細胞系。應為不合成或不分泌免疫球蛋白鏈型，含有符合骨髓瘤細胞的染色體特性，并有明確的來源歷史及符合規(guī)定的保存條件。

（2）免疫親代細胞

經抗原免疫的鼠脾B淋巴細胞或外周血B淋巴細胞。

應有明確的免疫原來源、性質及動物種系，免疫原具體的制備過程。

適宜的免疫方案及免疫淋巴細胞制備的辦法。

2．細胞融合與克隆化

采用適宜的辦法進行融合、篩選及克隆化。

3．雜交瘤細胞檢定

（1）抗體分泌穩(wěn)定性

持續(xù)克隆化后抗體陽性率達100%，經體外持續(xù)傳代3個月以上和重復凍存、復蘇，細胞系能保持穩(wěn)定分泌特異性抗體。

（2）細胞核學特性

檢查細胞分裂中期染色體，應符合雜交瘤細胞特性。

4．鼠源病毒檢查

按附錄規(guī)定檢測鼠源病毒。

5．支原體檢查

按現行《中國藥典》生物制品無菌實驗規(guī)程進行。

6．無菌實驗

按現行《中國藥典》生物制品無菌實驗規(guī)程進行。

（二）單克隆抗體的檢定

1．免疫球蛋白類及亞類

用免疫雙擴散法或其它適宜的辦法測定。

2．親和力

用可靠、精確的辦法測定單克隆抗體（下列簡稱為單抗）的親和常數或相對親和力。普通狀況下，對于免疫原為可溶性的單抗，測其親和常數，對于免疫原為顆粒性抗原的單抗，測其相對親和力。

3．特異性

測定單抗對靶抗原的特異性；對多株單抗識別的抗原決定簇進行有關性分析。

4．交叉反映

按附錄規(guī)定。

免疫組織化學法測定單抗與人體組織交叉反映，用冰凍及石蠟包埋的多個正常臟器組織測定。來源于腫瘤有關抗原的單抗應進行與多個腫瘤組織的交叉反映實驗。

5．效價測定

用適宜辦法測定。

（三）其它原材料

1．細胞培養(yǎng)用小牛血清

支原體檢測應為陰性。經小量實驗適于雜交瘤細胞生長。

2．培養(yǎng)液

應有培養(yǎng)液來源，質量指標。

3．化學試劑

規(guī)格應達成分析純以上。

二、基因工程抗體

參考《人用重組DNA制品質量控制技術指導原則》和本指導原則中的有關規(guī)定進行。

三、細胞庫的建立

應分別建立原始細胞庫、主細胞庫、工作細胞庫的三級管理細胞庫，普通狀況下主細胞庫來自原始細胞庫、工作細胞庫來自主細胞庫。各級細胞庫應有具體的制備過程、檢定狀況及管理規(guī)定等。

四、單抗生產

涉及用小鼠腹水法和細胞培養(yǎng)法制備。

（一）小鼠腹水法

1．小鼠

制備腹水必需使用合格的SPF級BACB/C小鼠或BACB/C和瑞士小鼠雜交子一代。

2．動物實驗設施

動物實驗設施應有有關部門頒發(fā)的二級以上合格證。

3．腹水制備

取適量擴增培養(yǎng)的雜交瘤細胞注射小鼠腹腔制備腹水，小鼠能夠預先用液體石蠟或降植烷等解決。

（二）細胞培養(yǎng)法

能夠采用發(fā)酵罐培養(yǎng)，亦可用細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)收集上清液制備單克隆抗體。培養(yǎng)基用無牛血清或低牛血清培養(yǎng)基，不能用-內酰胺類抗生素。

（三）抗體純化

可采用鹽析法、分子篩層析、離子交換親和層析等適宜的辦法。

1．盡量選用某些不引發(fā)免疫球蛋白聚合、變性等的純化辦法及條件。

2．應驗證所用的純化辦法能去除可能存在的非目的產物污染，如不需要的免疫球蛋白分子、宿主DNA、用于生產腹水抗體的刺激物、內毒素、其它熱原質、培養(yǎng)液成分或層析柱析出成分等。

3．應驗證所用的純化辦法能有效的去除/滅活病毒。

4．持續(xù)產生的各批產品必須符合質檢規(guī)定，批間含有良好的重復性。

5．純化后解決

必要時對純化后抗體采用適宜辦法進行解決。

（四）半成品、成品制備

五、檢定

涉及原液（小鼠腹水、細胞培養(yǎng)上清液、純化抗體）、半成品及成品的檢定等。

（一）物理化學檢測

1．外觀

液體制劑應為靠近無色微帶乳光的澄清液體，不應含有異物、渾濁或搖不散的沉淀。

2．pH值

電位法測定

3．蛋白質含量的測定

用Lowry法或其它適宜的辦法測定。

4．純度測定

（1）電泳法

用還原和非還原條件SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法。掃描后免疫球蛋白含量應達成95%以上，二聚體≤10%。

（2）HPLC法

純度應≥95%。

（3）多聚體測定

用FPLC或HPLC法，用適宜的分子篩層析，多聚體應≤10%。

5．DNA含量測定

用DNA分子雜交法。每一劑量殘存鼠骨髓DNA含量不高于100pg。

6．水分

產品如為凍干制品，應進行殘存水分測定，其含量應≤3%。

（二）生物學檢定

1．活性及效價測定

用適宜辦法進行。

2．鼠源病毒檢定

同上鼠源病毒檢查。

3．無菌實驗

同上無菌實驗。

4．支原體檢定

同上支原體檢定。

5．安全實驗

用小白鼠和豚鼠進行實驗。

6．熱原質實驗

按照現行版《中國藥典》生物制品熱原質實驗規(guī)程進行。采用家兔法時，家兔注射劑量=（人用劑量/50）*20*家兔體重（kg）。也可用鱟試劑法，1mg/mL蛋白濃度不應檢測出有凝集活性。

7．異常毒性實驗

（三）非免疫球蛋白雜質分析

涉及來源于細胞基質、培養(yǎng)基和下游工藝的有關雜質，采用適宜的技術和辦法進行分析檢測。

六、經修飾的單克隆抗體

為了提高單克隆抗體在治療和體內診療中的作用，慣用單抗與毒素、藥品、放射性核素或其它物質偶連形成免疫結合物，或在同一段多胎鏈包含非免疫球蛋白和免疫球蛋白序列的嵌合重組蛋白來獲得。研究者除對前面提到的有關未偶連單克隆抗體（未修飾單克隆抗體）的規(guī)定外，還應提供下列內容：

（一）免疫結合物的構建

應提供構建免疫結合物所用試劑和過程的具體資料，涉及：

1．描述與單克隆抗體連接的成分如：毒素、藥品、酶及細胞因子，涉及：全部成分的來源、構造、制法、純度及特性。

2．制備免疫結合物所用化學試劑的描述，如連接劑和螯合劑。這些資料應當涉及試劑來源、制備辦法，以及合成或純化時殘留雜質的測定等內容。還應提供合成反映途徑的圖解，以及與免疫結合物中所用化學試劑毒性有關資料。

3．在擬定成品的原則時應首先擬定該原料與抗體的平均結合率及每個抗體被結合部分的數量，并揭示免疫球蛋白置換數量、效力和穩(wěn)定性間的關系。

4．用重組DNA技術制備的制品（如來源于轉染細胞系或微生物培養(yǎng)基，嵌合的、易形的，互補決定區(qū)［CDR］接合的及單鏈Fv抗體，以及重組免疫結合物）應提供構建和置備過程的全部資料。重組免疫結合物的穩(wěn)定性應認真研究。因聚合物形成構形變化或變性而削弱了特異免疫反映性（如通過重組Fvs形成"雙抗"）可能造成藥代動力學的變化和/或與非靶組織結合。

（二）免疫結合物的純度

1．應采用特殊方法確?？贵w盡量無外源免疫球蛋白或非免疫球蛋白污染，因這些污染物質在構建免疫結合物過程中，能與核素、毒素或藥品發(fā)生反映。

2．應規(guī)定最后產品中游離抗體或游離組分的限量?；钚灾虚g體應被滅活或去除。

（三）免疫結合物的免疫反映性，效力及穩(wěn)定性

毒素或藥品偶聯至抗體上會變化其中任一成分的活性。

1．應采用適宜的辦法；評定偶聯前后的免疫反映性。

2．免疫結合物非免疫球蛋白成分的活性應在適宜的時候用效力實驗來進行評定（例如，毒素、細胞因子或酶等），用于造影的放射性免疫結合物除外。

3．免疫結合物構建后，應擬定免疫反映性變化的百分率限值，并作為產品規(guī)格的構成部分。

4．應通過在合并的人血清中37℃無菌條件下孵育，來檢測免疫結合物在體外的穩(wěn)定性。如果所用抗凝劑不會影響免疫結合物的穩(wěn)定性，血漿能夠用來替代血清。通過規(guī)定間隔時間分析樣品中完整免疫結合物及分解產物的濃度。應具體闡明評定產品的穩(wěn)定性的條件及所用陰、陽對照。

（四）與放射性核素偶聯單克隆抗體的特殊問題

放免結合物應用原則化的、嚴格控制并通過驗證的辦法制備。應建立檢測游離同位素、結合單克隆抗體、標記的非免疫球蛋白物質的放射性百分率的辦法。

1．放射性標記單克隆抗體的初始研究用新藥申報包含持續(xù)3次放射標記試生產的分析成果，應證明所制備的產品未變化免疫特異性、無菌、無熱原質。放射性標記試生產應由在研究中對單克隆抗體進行放射性標記及使用試劑的同一組人員進行。

2．制備免疫結合物時應使用放射性藥品及同位素并應提供其無菌及無熱原質的分析證書及橫向參比的信涵。

3．在標記試生產過程中，應測定最后產品中共價結合的和游離的同位素的濃度，以及標記試劑及其分解產物的殘留水平。

4．應描述給每一種病人應用前后進行的質控實驗。

5．適宜的時候，應檢測免疫結合物形成膠體的狀況，并對其進行限定。

6．有關單抗制備中放射性標記物的質控原則參考國家有關放射性藥品規(guī)定。

七、產品穩(wěn)定性

產品穩(wěn)定性應滿足臨床方案制訂的規(guī)定。加速穩(wěn)定性實驗資料可作為產品審批及標定用，但不能替代實際的穩(wěn)定性資料。

（一）應制訂穩(wěn)定性檢定規(guī)劃，涉及在規(guī)定效期全過程中，每間隔一定時間進行制品的物理化學完整性實驗（如斷裂或聚合），效力實驗，無菌實驗，以及水分、pH和防腐劑的穩(wěn)定性測定。

（二）確保制品生物活性的穩(wěn)定性實驗（例如定量體外效率實驗）應涉及廠內參比品。如可能在實驗的全過程中只使用一批實驗抗原（如：純化的抗原、細胞或組織）。應用定量效力實驗使對生物活性進行故意義的比較成為可能。

（三）加速穩(wěn)定性實驗，既將制品儲存在溫度高于常規(guī)儲存溫度后的穩(wěn)定性實驗，可能有助于鑒定及建立穩(wěn)定性批示實驗。表達穩(wěn)定性的特定參數應通過對每一批制品用趨向分析辦法進行監(jiān)測。

八、臨床前研究

由于生產條件或配方的變化可引發(fā)制品生物活性的明顯變化。因此，建議在臨床前研究中所使用的單抗應與臨床實驗中擬使用的單抗的生產工藝一致。

（一）交叉反映性實驗

當相似或有關抗原決定簇在人的非預定的細胞或靶組織體現時，可觀察到抗體與它們結合。非靶組織結合可能含有嚴重后果，特別是使用藥理活性抗體或細胞毒性免疫結合物時。因此，普通在Ⅰ期臨床實驗前應通過用人組織或細胞進行交叉反映性或非靶組織結合的實驗室檢測。對于雙特異性抗體，除檢測雙特異性產品外，還應對每株親本抗體進行逐個評定。

1．檢測交叉反映性的體外實驗

現在，用人細胞或組織進行免疫細胞化學及免疫組織化學技術檢測，應使用有效的并被確認的新技術（參考1．2．4）。

2．測定交叉反映性的體內實驗

當有適宜模型時，單克隆抗體與非靶人組織的交叉反映性應在動物中進行一次綜合的體內實驗。實驗成果，特別是對含有溶細胞性的免疫結合物或含有ADCC活性的抗體，普通規(guī)定進行更廣泛的臨床前實驗，涉及用一種以上動物超劑量及重復劑量進行動物實驗。設計臨床實驗時應考慮對非靶組織的定位。

（二）臨床前藥理學和毒性實驗

1．設計單克隆抗體臨床前安全實驗是為了預測在人體中可能的毒性

評定在人體中潛在不良反映副作用的可能性和嚴重程度，并可能擬定安全初始劑量和逐步提高劑量。有關單克隆抗體的臨床前實驗，涉及免疫原性、穩(wěn)定性、組織交叉反映性和效應功效。

2．動物毒理學研究

當設計單克隆抗體的毒理學實驗時，應考慮以下：

（1）若被試樣品為未偶聯抗體，且無適宜的動物模型或無攜帶有關抗原的動物，且與人組織交叉反映性實驗明顯陰性，則毒理學實驗不是必須的。

（2）動物體內有關抗原的性質與人體內有關抗原的生物學分布、功效及構造應含有可比性。但是，對于所用的動物模型，不必規(guī)定對單克隆抗體的抗原密度或親和力絕對相等。例如，結合力差別可通過增加劑量或服藥頻率來彌補。應鑒定動物和人之間存在的抗原數，單克隆抗體的抗原親和力或對單克隆抗體結合的細胞應答反映等方面存在的差別。這能夠更精確的推斷人用的安全初始劑量,并評定安全范疇。

（3）對單克隆抗體普通不規(guī)定進行常規(guī)誘變性的評定。

（4）擬給育齡婦女重復或長久使用的產品，應當用適宜的動物模型進行重復的進一步的研究涉及致畸實驗。

3．藥效學和動物藥代動力學

（1）當有動物模型時，則應盡量證明藥理學效應與劑量的依賴性，以及有效劑量的范疇，能夠更加好地預測治療指數；當無適合動物模型時，則應盡量以人外周血、組織器官等進行體外藥效學研究。當有動物模型時，藥代動力學的有關資料（生物學分布，半衰期等）能夠從動物模型中得到；當無適合動物模型時，動物藥代動力學能夠考慮不做，加強臨床實驗時藥代動力學方面的監(jiān)控。

（2）下列方面能夠指導藥代動力學幾藥效學實驗動物種類的選擇：

①最佳選擇與人有交叉反映或相似靶抗原的動物模型來進行實驗。對于僅抗人而未在動物模型中體現的人抗原或外源抗原（細菌，病毒等）的未偶聯單克隆抗體，能夠不必用缺少靶抗原的動物做實驗。

②當有抗原結合資料表明靈長類為最有關種屬時，則對未偶聯的單克隆抗體的實驗采用非人靈長類動物是適宜的。

③應對使用正常嚙齒類動物和鼠異源移植模型精確預測單克隆抗體在人體的藥代動力學行為的可能性進行嚴格評定。異源移植模型對評定單克隆抗體與人體內腫瘤結合的能力更故意義。

（3）鼠源抗體對于小鼠為非免疫原性物質，但在人體內具免疫原性，這就使得在鼠內所得的重復劑量成果難以推至擬在人體內使用的重復劑量。使用完全人源的、嵌合的或"人源化的"單克隆抗體將出現對應的問題，在這種狀況下用嚙齒類動物進行重復劑量的研究意義不大。

4．用免疫結合物進行的臨床體內研究

（1）應在體內實驗免疫結合物的穩(wěn)定性

①應測定免疫結合物中每個組分在動物體內藥代動力學和組織分布，并且與未偶聯抗體的分布相比較。

②不同組分的靶組織和他們能引發(fā)的潛在的毒性應被證明。

（2）由于免疫結合物可能被降解或作用位點的活性不是單克隆抗體與靶抗原結合的成果，應對含有放射性核素、毒素或藥品的免疫結合物進行動物毒性實驗，盡管該種動物不存在靶抗原。根據免疫結合物組分的性質和其偶聯的穩(wěn)定性，對組分分別進行實驗是有道理的。應充足描述每個組分的毒性狀況、副反映的發(fā)生和嚴重程度。所得成果應與結合物穩(wěn)定性實驗親密有關。如可能，應用品有有關靶抗原或疾病模型動物體內進行免疫結合物實驗，如果不存在靶抗原陽性動物就在嚙齒類動物體內進行。游離毒素或核素的毒性實驗可在不同類動物中進行。

（3）對于放射性核素的免疫結合物：

①動物生物分布的資料可被用于對初始人用劑量的評定。

②如可能，體現靶抗原的動物模型更有可能發(fā)現抗原"減少"或帶有在生物分布和/或毒性方面體現意外抗原的組織。

③異源移植模型能夠組織定位和抗原非特異放射性免疫結合物分布問題，但對擬定普通組織交叉反映范疇沒有協助。

④應研究適宜的動物數量以用一種可接受的變異系數（普通不大于20%）對放射性劑量進行評定。

⑤對于使用放射性總量的新陳代謝和測定從早到晚去除期時間點的適宜數值應有完整計算