電針百會、風府和陽陵泉對帕金森病模型大鼠的治療作用及機理研究

電針百會、風府和陽陵泉對帕金森病模型大鼠的治療作用及機理研究

帕金森?。╬arkinson’sdisease，pd）也被稱為痙攣性麻麻痹性疾病，是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床上主要表現(xiàn)為沉默振動和運動遲緩。還有語言減少、聲音低沉、單調(diào)、吞咽困難、流涎、睡眠障礙、抑郁和癱瘓等癥狀，嚴重影響了患者的運動能力和生活質(zhì)量。由于PD的病因尚未完全明確,于是提出各種假說,如遺傳因素學說、氧化應激學說、環(huán)境因素學說、細胞凋亡學說等。而氧化應激學說在PD的發(fā)病中仍占主導地位。此外,由于PD是一種慢性進展性疾病,目前尚無根治的方法,治療以左旋多巴等藥物為主,但只能緩解臨床癥狀,且療效遞減性以及副作用(抑郁、焦慮、幻覺、欣快、精神錯亂、輕度躁狂等)一直是困擾人們的難題。近年來,針灸以其自身優(yōu)勢,在改善PD的運動障礙、延緩PD進程、減少左旋多巴的毒副作用、提高患者的生活質(zhì)量等方面已發(fā)揮了重要作用,逐漸受到人們的重視,針灸因此成為治療帕金森病的方法之一。本研究通過觀察電針“百會”、“風府”和“陽陵泉”對帕金森病模型大鼠氧化應激反應的影響,探討電針對帕金森病可能的作用機制。1材料和方法1.1動物SPF級雄性SD大鼠60只,體重180~220g,由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,許可證號:SYXK(滬)2004-2005。1.2藥物、試劑與儀器藥物及試劑:美多芭(上海羅氏制藥公司,批號SH11687),6-羥基多巴胺(美國Sigma公司,批號048k3728)、阿撲嗎啡(美國Sigma公司,批號100839-200601)、抗壞血酸(美國Sigma公司,批號063k1082),慶大霉素(上海第一制藥廠),丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所),戊巴比妥鈉(上海中西藥業(yè)股份有限公司,批號WS20090920),冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司),等。儀器:TOW-3A型大鼠腦立體定位儀(廣東汕頭市教育醫(yī)學儀器廠),XW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠),UV754N型紫外分光光度計(上海精密科學儀器有限公司),華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠),KWD-808型全能脈沖電療儀(上海電子儀器廠)等。1.3骨髓細胞注射治療采用經(jīng)典的PD模型。術(shù)前按常規(guī)進行行為測試,確認無異常旋轉(zhuǎn)行為后,用戊巴比妥鈉(3%的戊巴比妥鈉,50mg/kg)腹腔注射麻醉。然后將大鼠固定于腦立體定位儀上,頭部去毛,苯扎溴銨常規(guī)消毒。無菌條件下,沿正中線切開大鼠顱頂皮膚,剝離骨膜,暴露前囟。以前囟為準,根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜,確定右側(cè)黑質(zhì)二坐標:①前囟后5.2mm,正中線右側(cè)1.0mm,硬膜下9.0mm。②前囟后5.2mm,正中線右側(cè)2.5mm,硬膜下8.5mm。用顱骨鉆于手術(shù)要求部位小心鉆開顱骨,用5μL微量進樣器將6-OHDA(溶于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水中,即秤量藥品抗壞血酸0.001g,溶于生理鹽水0.5mL中)注入右側(cè)黑質(zhì)部(以1.0mm/min速度緩慢進針),每孔3μL,注射速度為1μL/min,注射完畢后留針5min,然后以1.0mm/min速度緩慢退針。手術(shù)完成后,用醫(yī)用明膠海綿填塞顱骨孔,縫合切口皮膚,肌肉注射慶大霉素7d,待動物清醒后放回飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)。正常對照組只固定大鼠,不進行任何處理。10d后,以腹腔注射APO0.5mg/kg誘發(fā)大鼠向一側(cè)旋轉(zhuǎn),記錄從開始旋轉(zhuǎn)至30min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)圈數(shù),以旋轉(zhuǎn)圈數(shù)平均>7次/min者為合格的PD模型。1.4模型組和方法將成功PD模型大鼠(31只)隨機分為4組:①電針組9只:采用類比法取穴,腧穴定位如下:風府:在大鼠頭項部,枕外隆凸直下凹陷處;百會:在大鼠頭頂部,兩耳尖連線的中點處;陽陵泉:在大鼠小腿外側(cè),膝關(guān)節(jié)下外1.5cm處。用0.25×13mm的針灸針,刺0.6~1cm深,稍行提插捻轉(zhuǎn)手法。使用全能脈沖電療儀,正、負電極輸出線分別夾在“百會”、“風府”和雙側(cè)“陽陵泉”穴位上的毫針針柄上。選用斷續(xù)波型,電針頻率為5hz,電流強度為20mA左右,以肌肉出現(xiàn)輕微抽動為準。每次刺激時間為15min,每日1次,每周6次,共治療4周。②美多芭組8只:灌胃給藥,劑量135mg/kg(10mL/kg),每日1次,每周6次,共給藥4周。③電針結(jié)合美多芭組8只:方法如電針組治療結(jié)合美多芭組治療,每日1次,每周6次,共治療4周。④模型組6只:不做任何處理。正常對照組6只也不做任何處理。各組除干預措施不同外,其余各條件一律相同。1.5腦黑質(zhì)塊的勻漿治療結(jié)束后,立即斷頭取腦,小心分離黑質(zhì),制備腦黑質(zhì)勻漿液。操作方法:取腦黑質(zhì),在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,放入10mL的勻漿管內(nèi);在勻漿管中加冷的0.86%鹽水0.65mL,用眼科剪盡快剪碎腦黑質(zhì)塊;再加入冷的0.86%生理鹽水0.3mL進行充分勻漿。將勻漿液以4000r/min離心15min,將上清液置-20℃冰箱中備用。1.6mda,gsh,gsh-px和sod的檢測氧自由基檢測方法:取適量上清液進行MDA,GSH,GSH-Px和SOD的檢測,具體方法按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書步驟進行測試。1.7統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)用(mean±s)表示,兩組間各參數(shù)比較采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,t檢驗方法進行統(tǒng)計學分析,其中P<0.05說明兩組之間差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01說明兩組之間差異有統(tǒng)計學意義。2各組大鼠sod、gsh-px活性的比較動物造模成功率57.41%.與正常對照組比較,模型組SOD活性降低,MDA含量升高,GSH含量降低,GSH-PX活性降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組比較,電針組、美多芭組、電針+美多芭組均能提高SOD、GSH-Px活性,提高GSH含量和降低MDA含量,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而美多芭組,電針組和電針+美多芭組黑質(zhì)中SOD、MDA、GSH和GSH-Px含量測定結(jié)果比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(見表1)3陽陵泉穴及其及其三穴治療對帕金森病模型大鼠氧化應激反應的影響《資生經(jīng)》曰:“百會”又名天滿,屬督脈,為督脈與足太陽、手足少陽和足厥陰五條經(jīng)脈之所會,故有“三陽五會”之稱,《針灸大成》中稱“主心煩悶,驚悸健忘,忘前失后,心神恍惚”,具開竅醒神之功,針刺“百會”可以激發(fā)頭部和諸經(jīng)經(jīng)氣,治療腦病和十四經(jīng)病,調(diào)一身之陰陽氣血,補腦益髓。風府穴出自《素問》,“頭重,身痛,惡寒,治在風府”,《備急千金要方》風府主治“舌緩,不能言”,這些臨床癥狀似屬于帕金森病癥狀范疇;針刺風府穴可以振奮督脈陽氣,宣散風邪,調(diào)理氣血,使經(jīng)脈氣血疏通,臨床帕金森病治療有較多應用。陽陵泉穴始出自《靈樞·邪氣臟腑病形》篇,是足少陽膽經(jīng)合穴,又是八會穴之一的“筋會”,位于小腿外側(cè)當腓骨頭前下方凹陷處,是臨床的常用穴;具有強健腰膝、通絡止痛等功效;近年來,陽陵泉穴單穴或處方配穴應用治療多種疾病,如肩周炎、膝關(guān)節(jié)炎、面肌痙攣、偏癱、坐骨神經(jīng)痛、扭挫傷等病證;臨床研究認為針刺陽陵泉,對調(diào)整腦血流量有一定影響,對急性缺血性中風患者,通過針刺治療取得良好療效?；谏鲜鲈蚣捌渑R床在治療帕金森病的應用,本實驗針對性的選擇“百會”、“風府”和“陽陵泉”三穴,并考察電針該三穴位對帕金森病模型大鼠氧化應激反應的影響,探討電針對帕金森病可能的作用機制。本實驗結(jié)果表明,模型組與正常對照組比較,SOD活性降低,MDA含量升高,GSH含量降低,GSH-PX活性降低,提示帕金森病大鼠的氧化反應被激活,處于氧化應激狀態(tài);同時說明機體清除氧自由基的能力低,細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性受損,機體細胞受自由基攻擊的程度加重。與模型組比較,美多芭組、電針組、電針結(jié)合美多芭組均能提高SOD活性,提高GSH-Px活性,提高GSH含量和降低MDA含量,說明三種治療方法均能使機體清除氧自由基的能力提高,機體細胞受自由基攻擊的程度減輕,對細胞膜結(jié)構(gòu)