香石竹莖尖培養(yǎng)及無菌萌發(fā)研究

香石竹莖尖培養(yǎng)及無菌萌發(fā)研究

香石和竹子花期大、美麗、芳香。它是世界上的四大花卉之一，現(xiàn)在也是中國最重要的花卉品種。香石竹的病毒病十分嚴(yán)重,極大地影響了香石竹切花的品質(zhì)和產(chǎn)量。業(yè)已證明,為害香石竹的病毒主要有6種。和其他植物病毒病一樣,目前尚未找到一種化學(xué)藥物可以根治香石竹病毒病。唯一有效的途徑是利用莖尖分生組織培養(yǎng)技術(shù)脫除病毒,生產(chǎn)無毒苗。本研究旨在通過對(duì)香石竹脫毒、快速繁殖的各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究,解決香石竹無毒苗工廠化生產(chǎn)的技術(shù)問題。培養(yǎng)條件及培養(yǎng)方法一、材料和接種試材為Nbgrlago,Hellas,OrangeTriumph,Milo四個(gè)品種。大田和溫室取材,常規(guī)無菌操作接種。外植體為帶2個(gè)葉原基的莖尖(0.2～0.3mm)和帶4個(gè)葉原基的莖尖(0.3～0.5mm)二、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件起始培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基為R1、R2、R3和R4,生根培養(yǎng)基為MS和CR2,蔗糖3%,瓊脂0.6%,pH5.8～6.0。培養(yǎng)基常規(guī)高壓滅菌。培養(yǎng)條件為25±2℃,RH60～80%,起始培養(yǎng)和生根培養(yǎng)時(shí)光強(qiáng)為1000～2500lx,生根培養(yǎng)時(shí)光強(qiáng)為2500～4500lx,日光燈照明,10～12h/d。三、繼代、生根培養(yǎng)和冷藏繼代時(shí)將叢生芽切成單株,并及時(shí)淘汰玻璃化芽和劣芽。每30～45天繼代一次。選粗壯、長勢均一的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)。冷藏時(shí),連同培養(yǎng)瓶一起置2～4℃冰箱中保存,培養(yǎng)基為R3。四、試管苗移栽、扦插和管理移栽前開瓶馴化2～3天,移栽時(shí)選用粗壯、均一、無變異的試管苗。扦插I:將生根培養(yǎng)延長到35～40天,待苗長到7～10cm高時(shí)再移栽。移栽時(shí),把試管苗切成兩段,帶根部分移栽,無根部分扦插。扦插Ⅱ:從移栽成活的試管苗中選出無毒母株,從母株上打頭扦插。基質(zhì):B—1至B—7,由不同比例的珍珠巖、石和園土混合而成。園土在121℃下高壓滅菌2小時(shí)。環(huán)境條件:白天20～25℃,夜間10～20℃;移栽前10天RH90～100%,以后慢慢降至自然相對(duì)溫度;前10天光強(qiáng)1000～2500lx,以后逐漸提高到自然光強(qiáng)。用35目尼龍網(wǎng)隔離。五、病毒檢測采用(1)癥狀分析法;(2)指示植物法,指示植物為莧色黎(Chenopodiumamaranticolor)、昆諾阿黎(C.quinoa)、美國石竹(Dianthusbarbatus)、和高雪輪(Silencearmeria),采用磷酸緩沖液(0.05mol/L、pH7.0),方法仿張健如。分別在試管階段和移栽成活后進(jìn)行檢測,重復(fù)3次?？偯摱韭?脫毒率×成活率。結(jié)果與討論一、葉原基對(duì)莖尖成活率的影響起始培養(yǎng)基的選擇:從表1可見,起始培養(yǎng)基對(duì)玻璃化率無顯著影響,但對(duì)莖尖的成活率有顯著影響。同樣大小的莖尖在R4上成活率最高,其中帶2個(gè)葉原基的莖尖成活率為38.8%,帶4個(gè)葉原基的莖尖成活率為56.6%。這表明脫毒時(shí)選用R4為起始培養(yǎng)基是適宜的。二、種子計(jì)檢測劑為離體繁殖和冷藏:試驗(yàn)表明,芽在R3上繁殖系數(shù)一直最高,而且有時(shí)與R2、R4有顯著差異。觀察結(jié)果還表明,在R2、R3上的芽生長旺盛,莖粗壯,整齊度高,在R4上的芽矮小,不整齊。在玻璃化方面,三種培養(yǎng)基無明顯差異。在長期繼代時(shí),芽在R2、R3上變異較少,在R4上變異較多。根據(jù)上述結(jié)果,我們選R3為增殖培養(yǎng)基。利用R3培養(yǎng)基對(duì)試管苗進(jìn)行冷藏試驗(yàn)。結(jié)果表明,在2～4℃冰箱中,材料保存4～5個(gè)月后與在正常培養(yǎng)條件下的材料相比,葉片肥大,莖變粗,葉黃化,但轉(zhuǎn)到正常培養(yǎng)條件下,很快恢復(fù)正常生長。生根培養(yǎng):采取兩種方法:(1)要生根的芽先在MS上過渡培養(yǎng)15～20天,然后再轉(zhuǎn)到新MS上生根培養(yǎng),20～25天后生根率達(dá)100%。(2)直接移到CR2上生根培養(yǎng)。芽在CR2上培養(yǎng)17天后生根率達(dá)92%,培養(yǎng)25天后生根率達(dá)100%。移栽:表3列出了七種不同基質(zhì)對(duì)試管苗成活率的影響,除在B—7中苗的成活率為86.0%以外,其他均在90%以上。但考慮到B—1、B—3和B—5不含園土,不需要滅菌處理,而且通過噴施營養(yǎng)液可以控制苗的生長,小苗成活后的移栽和運(yùn)輸也較為方便等優(yōu)點(diǎn),因此我們選用這三種基質(zhì)為移栽基質(zhì)。另外,試管苗的質(zhì)量對(duì)其成活率和生長具有很大影響。粗壯、生長旺盛的試管苗移栽后生根速度快,成活率高,根系發(fā)達(dá)。扦插Ⅰ:扦插Ⅰ和試管苗移栽同時(shí)進(jìn)行。由表4可見,兩者的成活率無顯著差異,說明扦插Ⅰ可行。這樣可以使苗子產(chǎn)量加倍,成本降低。扦插Ⅱ:選用B—1、B—3和B—5為基質(zhì)進(jìn)行扦插II試驗(yàn),結(jié)果表明,成活率均在97.0%以上(表5)。為加速生根,用不同濃度NAA對(duì)插頭進(jìn)行處理,結(jié)果800mg/L促進(jìn)生根的效果較好。香石竹無毒苗工廠化生產(chǎn)可分兩部分:(1)獲得無毒材料,即通過莖尖分生組織培養(yǎng)脫除病毒,獲得無毒芽;(2)繁殖,采用兩條途徑:一是以組織培養(yǎng)為主同時(shí)結(jié)合扦插進(jìn)行繁殖,它適合于大批量的生產(chǎn)。其特點(diǎn)是:冷藏試管無毒材料所需要的空間少,扦插I使產(chǎn)量增加1倍,降低了生產(chǎn)成本;二是利用無毒母株扦插繁殖,即扦插Ⅱ。在我國溫室面積少、成本高、香石竹種苗需求季節(jié)性強(qiáng)的情況下,它只適應(yīng)于小批量生產(chǎn),其優(yōu)點(diǎn)是速度快。我們認(rèn)為在實(shí)際生產(chǎn)中香石竹無毒苗的生產(chǎn)要根據(jù)無毒苗的需求量和供貨時(shí)間確定適宜的繁殖方法。莖尖大小的選擇:莖尖大小顯著地影響其成活率和脫毒率(表1、表2)。帶4個(gè)葉原基的莖尖的成活率顯著