第十四章 酶類藥物

第十四章酶類藥物酶藥用酶是用于預(yù)防、治療、診斷疾病的一類酶制劑。生物體內(nèi)的各種生化反應(yīng)幾乎都是在酶的催化作用下進(jìn)行的，當(dāng)酶的生物合成受到影響或酶的活力受到抑制，生物體的代謝受阻就會出現(xiàn)各種疾病。此時，若給機(jī)體補(bǔ)充所需要的酶，使代謝障礙得以解除，從而達(dá)到治療和預(yù)防疾病的目的。藥用酶制劑，早期主要用于治療消化道疾病、燒傷及感染引起的炎癥。現(xiàn)在，國內(nèi)外已廣泛用于多種疾病的治療，其制劑已超過700余種。促進(jìn)消化酶類消炎酶類與治療心腦血管疾病有關(guān)的酶類抗腫瘤的酶類與生物氧化還原電子傳遞有關(guān)的酶其他藥用酶藥用酶的來源和生產(chǎn)直接從生物體中分離獲得早期，例如：豬頜下腺提取激肽釋放酶、菠蘿中提取菠蘿蛋白酶利用微生物發(fā)酵從動物或植物中提取酶受到原料的限制，隨著酶應(yīng)用日益廣泛和需求量的增加，工業(yè)生產(chǎn)的重點已逐漸轉(zhuǎn)向微生物。用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)藥用酶，不受季節(jié)、氣候和地域的限制，生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量高，成本低，能大規(guī)模生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成生化制備法選擇符合要求的動植物材料生物材料的預(yù)處理提取純化1.生物材料的選擇（1）不同酶的用料選擇（2）注意不同生長發(fā)育情況及營養(yǎng)狀況,用微生物制酶，故需測其活力來決定取酶階段。用動物器官提取酶，則與動物年齡及飼養(yǎng)條件有關(guān)。（3）綜合成本：從原料來源是否豐富考慮，從簡化提純步驟著手（5）如用動物組織作原料，則此動物宰殺后應(yīng)立即取材。

2.生物材料的預(yù)處理

材料選定通常要進(jìn)行處理。要剔除結(jié)締組織及脂肪組織。如不能立即進(jìn)行實驗，則應(yīng)冷凍保存。

酶蛋白在細(xì)胞內(nèi)外的分布有三種情況：—是釋放到細(xì)胞外的酶，叫胞外酶；二是游離在細(xì)胞內(nèi)的酶．叫溶酶；三是牢固與膜或細(xì)胞顆粒結(jié)合在—起的，叫結(jié)酶，后二者合稱胞內(nèi)酶。由于酶蛋白分布不同，提取方法有所差異。

微生物胞外酶，用鹽析，或有機(jī)溶劑沉淀等從發(fā)酵液中沉淀酶，制成酶泥。胞內(nèi)酶需收集菌體，經(jīng)破細(xì)胞后提取。其中結(jié)酶還有個打斷酶蛋白和細(xì)胞顆粒結(jié)合的問題。動植物細(xì)胞，也有打破細(xì)胞的問題，對動物材料，應(yīng)剔除結(jié)締組織、脂肪組織等；對植物材料如種子應(yīng)去殼．以免單寧等物質(zhì)著色污染。a、機(jī)械處理用絞肉機(jī)絞，成為組織糜。許多酶可以從較粗的組織糜中提取出來，但不能太粗。選擇孔徑，先粗后細(xì)。用絞肉機(jī)一般細(xì)胞并不破碎。有的酶必須細(xì)胞破碎后才能有效地提取，在實驗室常用的是玻璃勻漿器和組織搗碎器。工業(yè)上用高壓勻漿機(jī)。b、反復(fù)凍融冷到-10℃左右，再緩慢溶解至室溫，如此反復(fù)多次。由于細(xì)胞中冰晶的形成，及剩下液體中鹽濃度的增高，能使細(xì)胞中顆粒及整個細(xì)胞破碎，從而使某些酶釋放出來。c、丙酮粉組織經(jīng)丙酮迅速脫水干燥制成丙酮粉，不僅可減少酶的變性，同時因細(xì)胞結(jié)構(gòu)成份的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的某些化學(xué)鍵打開，促使某些結(jié)合酶釋放到溶液中。常用的方法是：將組織糜或勻漿懸浮于0.0lmol／L，pH6.5的磷酸緩沖液中，在0℃下一邊攪拌，一邊徐徐倒入10倍體積的-15℃無水丙酮內(nèi)，10分鐘后，離心過濾取其沉淀物，反復(fù)用冷丙酮洗幾次，真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低溫下可保存數(shù)年。d、微生物的預(yù)處理要是酶是胞外酶，則可除去菌體后再直接從發(fā)酵液中吸附提取酶。但對胞內(nèi)酶則需將菌體細(xì)胞破壁，制成無細(xì)胞的懸液后再行提取。通常用離心或壓濾獲得菌體。絮凝劑：(1)絮凝劑中和了懸浮粒子表面上的電荷(菌體細(xì)胞表面上亦存在著羧基和氨基，故帶有電荷)，最終導(dǎo)致了這些粒子的絮凝。(2)絮凝劑的包埋或吸附作用，把菌體及其它不溶性粒子機(jī)械地吸附并包埋在其中。菌體用生理鹽水洗滌除去培養(yǎng)基后，應(yīng)深凍保存。3、酶的提取a、水溶液法常用稀鹽溶液或緩沖液提取。組織糜、勻漿、細(xì)胞顆粒、丙酮粉溫度溫度通?？刂圃?一4℃左右.如果酶比較穩(wěn)定時，可以例外。如胃蛋白酶可在37℃F保溫抽提。pH，首先考慮酶的穩(wěn)定性。選用pH不應(yīng)超過酶的PH穩(wěn)定范圍。其次，從抽提效果出發(fā)，最好遠(yuǎn)離待抽提酶的等電點。也就是說，酸性蛋白宜用堿性溶液抽提；堿性蛋白宜用酸性溶液抽提。第三，在某些情況下，抽提還兼有切斷酶與細(xì)胞內(nèi)其它成分間可能有的聯(lián)系，從這點出發(fā)，選用pH4—6為佳。鹽，大多數(shù)蛋白質(zhì)在低濃度的鹽溶液中有較大的溶解度。所以，抽提液一般采用等滲溶液。最普通的為0.020—0.050mol/L的磷酸緩沖液,0.15mol/LNaCl等。據(jù)報道，少數(shù)情況下用水抽提亦佳,這可能與低滲破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān).抽提液用量抽提液用量常采用原料量的1—5倍。有時，為了抽提效果好些需要反復(fù)抽提時．抽提溶液比例可能大些.b、有機(jī)溶劑法某些結(jié)合酶如微粒體和線粒體膜的酶，由于和脂質(zhì)牢固結(jié)合，為此必須除去結(jié)合的脂質(zhì)，且不能使酶變性，最常用的有機(jī)溶劑是丁醇。正丁醇兼有高度的親脂性和親水性(特別是磷酸鹽)，能破壞蛋白間的結(jié)合使酶進(jìn)入溶液，如琥珀酸脫氫酶。c、表面活性劑法表面活性劑能與蛋白質(zhì)結(jié)含而分散在溶液中，故可用于提取結(jié)合酶。如膽脂酸鹽、Triton、Tween、Teepol、十二烷基磺酸鈉等抽提后的細(xì)胞殘渣或固體成分可用離心或過濾除上，在離心時，加入氫氧化鋁凝膠或磷酸鈣等物質(zhì)，有助于除去懸浮的膠體物質(zhì)。有些工業(yè)上用酶還需要脫色。但需考慮：在酶的提取分離過程中的什么階段進(jìn)行脫色處理，使脫色工作量最少，又不由于脫色操作而引入雜質(zhì)。工業(yè)上常用的脫色劑是活性炭。活性炭的用量一般為0．1％一1．5％，根據(jù)色素的多少而增減。一般由于活性炭顆粒較小，采用靜態(tài)吸附法進(jìn)行脫色。4、酶的純化評價純化工藝主要看二個指標(biāo)，一是酶比活，二是總活力回收。

比活力(SpecificActivity)是酶純度的量度，即指：單位重量的蛋白質(zhì)中所具有酶的活力單位數(shù)，一般用IU/mg蛋白質(zhì)來表示。一般來說，酶的比活力越高，酶越純.

酶活力(EnzymeActivity)也稱酶活性，履指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力.在實踐工作中選擇方法時:首先應(yīng)對被純化的酶的理化性質(zhì)(如溶解度、分子量大小、穩(wěn)定性和解離時電學(xué)性質(zhì)等)有—個比較全面的了解，這樣，就可以知道在分離純化時可以選用那些方法和條件，避免哪些處理，從而得到好的純化效果;其次，判斷采用的方法和條件是否得當(dāng)，始終以測定酶活性為標(biāo)準(zhǔn)。一個好的方法和條件是比活力提高得多，總活力回收多酶在純化過程中的一些技術(shù)難點：（一）雜質(zhì)的除去酶提取液中，除所需酶外，還含有大量的雜蛋白、多糖、脂類和核酸等a、熱變性

利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最為簡便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子的初期分離純化。

如制備脂肪酶時，在pH3、4時以400C溫度加熱150min，淀粉酶活力可喪失90%而被除去，而脂肪酶活力仍保持80％以上。b、選擇性酸堿變性

利用蛋白質(zhì)和酶等對于溶液中酸堿不同pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀，通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的一個分離純化步驟。

c、蛋白質(zhì)表面變性法：

蛋白質(zhì)表面變性后其性質(zhì)有所不同，借以去除雜蛋白。如制備過氧化氫酶時，加入氯仿和乙醇進(jìn)行振蕩可以將雜蛋白變性而去除。d、選擇性變性法：