副溶血性弧菌的研究進展

副溶血性弧菌的研究進展

嗜血性嗜血性（vp）廣泛分布于海水、海床上的沉積物、浮游生物和魚類。這是由海糧引起急性胃腸炎的重要病原體之一。這種疾病是高度感染的，尤其是在沿海地區(qū)。許多人會因為食用引起本菌感染而在未煮好的海生物中中毒，發(fā)病率很高。在近年來沿海地區(qū)的微生物性食物中毒中,該菌已成為首要病原。僅美國1997、1998年就有4個州發(fā)生副溶血性弧菌食物中毒650例。自2001年以來,副溶血性弧菌性食物中毒已經(jīng)成為我國最常見的食源性疾患。目前,我國常規(guī)檢測方法大多要經(jīng)過前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定、神奈川現(xiàn)象和血清學反應(yīng)等過程。這些實驗操作繁瑣,需耗時5-6d,檢出率低,給海產(chǎn)品生產(chǎn)、出入境檢驗檢疫、食品衛(wèi)生監(jiān)督等帶來困難,不但影響經(jīng)濟發(fā)展,而且不利于及時診斷和控制流行病的傳染,不能滿足食品中病原菌快速檢測的現(xiàn)實需要。另外,傳統(tǒng)硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)的選擇效果不明顯,可疑菌落不易識別,當有其他的弧菌或腸道菌群存在時會影響副溶血性弧菌的檢出,給檢測技術(shù)人員帶來極大的工作量與不確定性。近年來,分子生物學的檢測技術(shù)已被廣泛應(yīng)用,使副溶血性弧菌的快速檢測有了很大發(fā)展。但是這些技術(shù)需要的設(shè)備費用較大、技術(shù)要求高、操作復(fù)雜,在基層檢測機構(gòu)不易推廣。而顯色培養(yǎng)基因為將微生物的分離與鑒定合二為一,具有省時省力、操作簡便、敏感性和特異性都較高的優(yōu)點,特別是能與常規(guī)檢測方法較好地接軌而越來越受到國內(nèi)外的關(guān)注。顯色培養(yǎng)基是根據(jù)酶的特征設(shè)計的對微生物進行快速檢測的一種分離培養(yǎng)基,基本原理是:在分離培養(yǎng)基中加入檢測某些菌種的特異性酶底物,該底物為人工合成,由產(chǎn)色基團和微生物可代謝物質(zhì)組成,通常為無色,但在特異性酶作用下游離出發(fā)色基團并顯示一定顏色,直接觀察菌落顏色即可對菌種做出初步鑒定,具有快速、簡便和經(jīng)濟的特點[5,10,11,12,13,14,15,16]。本實驗室應(yīng)用自主研發(fā)的HKM副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基與國外同類商品化產(chǎn)品對質(zhì)控菌株和天然污染的海產(chǎn)品樣品進行了測試,系統(tǒng)地比較了培養(yǎng)基的性能。1材料和方法1.1材料表面1.1.1菌株as1.3、as1.3、kra-pah3、陰溝腸桿菌sseid副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolytieus)ATCC17802、副溶血性弧菌ATCC33864、副溶血性弧菌15C、副溶血性弧菌17a、副溶血性弧菌23d、副溶血性弧菌24e、非O1霍亂弧菌(V.choleraenonO1)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)HK8031、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)ATCC2756、擬態(tài)弧菌(V.mimicus)As1.1969、嗜水氣單胞(Aeromollashydrophila)AS1.927、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853、阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)ATCC51329、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC25922、檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)ATCC8090、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)-57、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)CMCC(B)45301、亞利桑那氏菌(SalmonellaArizona)CMCC(B)47001、糞腸球菌(Streptococcusfaecalis)ATCC29212、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538。1.1.2硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖培養(yǎng)基HKM副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基(HKMVPM)由本實驗室研制,KHVPM為進口同類產(chǎn)品,堿性瓊脂、3%胰蛋白胨大豆瓊脂(3%TSA)、堿性蛋白胨水和硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供。MIDA+B鑒定條由英國Microgen公司提供。1.1.3樣品1.2方法1.2.1培養(yǎng)基制備1.2.2hkvmpm平板和khvpm平板培養(yǎng)將副溶血性弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、嗜水氣單胞、阪崎腸桿菌、大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、亞利桑那氏菌、金黃色葡萄球菌和糞腸球菌接種在營養(yǎng)瓊脂復(fù)蘇24h后,分別劃線接種HKMVPM平板和KHVPM平板,37°C培養(yǎng)18-24h。觀察不同細菌在顯色培養(yǎng)基上的菌落特征,比較兩種培養(yǎng)基對副溶血性弧菌的特異性反應(yīng)。1.2.3副溶血性弧菌的篩選分別用接種環(huán)挑取上述副溶血性弧菌的新鮮菌苔一環(huán),加入到10mL0.85%生理鹽水中配成原液,然后進行10倍梯度稀釋,取副溶血性弧菌濃度為103-104CFU/mL的菌液與霍亂弧菌、擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌組成混合菌液,各取50μL分別螺旋接種于HKMVPM平板和KHVPM平板,37°C培養(yǎng)18-24h。觀察副溶血性弧菌在兩種顯色培養(yǎng)基生長的情況,并對其進行菌落計數(shù),比較副溶血性弧菌在兩種顯色培養(yǎng)基上的生長率。1.2.4接枝型顯色平板將上述不同的實驗菌株分成4組,從I到IV組合中,副溶血性弧菌和霍亂弧菌的接種量不變,而擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌的接種量10倍遞增混合螺旋接種于兩種顯色平板上;同時用堿性瓊脂和3%TSA分別對霍亂弧菌、副溶血性弧菌、擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌的接種量進行計數(shù);組合V中為副溶血性弧菌與擬態(tài)弧菌按一定比例制成的凍干混合物;增菌用225mL堿性蛋白胨水,添加1mL相應(yīng)不增菌的組合中的菌液,37oC培養(yǎng)18h,將增菌液用螺旋接種法接種于兩種顯色平板上,37oC培養(yǎng)24±2h,比較兩種培養(yǎng)基的分離率與檢出限。1.2.5性蛋白水增菌液的制備取25g經(jīng)處理過后的樣品置于225mL堿性蛋白胨水增菌液的三角瓶中,37oC培養(yǎng)18h;增菌液分別劃線在兩種顯色平板和TCBS平板上,37oC培養(yǎng)24h,挑取可疑菌落。1.2.6分離和識別將疑似菌落分離純化,用英國Microgen公司的GNA+B鑒定條進行生化鑒定和確認。2結(jié)果2.1顯色培養(yǎng)基的篩選顯色培養(yǎng)基的特異性結(jié)果見表1,HKMVPM顯色平板和KHVPM顯色平板均有較好的顯色效果。兩種顯色培養(yǎng)基上副溶血性弧菌菌落均呈現(xiàn)特異性的品紅色;霍亂弧菌、創(chuàng)傷弧菌和擬態(tài)弧菌均呈現(xiàn)藍綠色;溶藻弧菌、亞利桑那氏菌和銅綠假單胞菌在該顯色培養(yǎng)基上均為無色菌落;陰溝腸桿菌呈灰黑色菌落;其他腸道桿菌顯藍綠色菌落,生長均受抑制;糞腸球菌雖顯品紅色,但生長受抑制;金黃色葡萄球菌在顯色培養(yǎng)基上顯它本來的金黃色,且生長受抑制。實驗結(jié)果表明,大部分腸道菌和金黃色葡萄球菌對副溶血性弧菌的辨認無干擾作用,副溶血性弧菌顯色培養(yǎng)基具有較高的選擇性和特異性;而在TCBS平板上,創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌和嗜水氣單胞菌與副溶血性弧菌均顯藍綠色,不能區(qū)分。2.2hkvmpm和khvpm顯色培養(yǎng)基的檢測效率各實驗菌株在不同顯色培養(yǎng)基中的靈敏度和生長率試驗結(jié)果見表2,結(jié)果顯示對副溶血性弧菌ATCC17802、ATCC33864、17a和23d的檢出率,HKMVPM和KHVPM顯色培養(yǎng)基沒有顯著差異,兩種顯色培養(yǎng)基可以達到相同的靈敏度和檢測限,但對副溶血性弧菌15C和24e,HKMVPM顯色培養(yǎng)基則優(yōu)于KHVPM;在HKMVPM和KHVPM顯色培養(yǎng)基上副溶血性弧菌仍呈特殊的品紅色菌落,而其他弧菌呈現(xiàn)藍綠色或無色菌落,表明其他弧菌基本不影響副溶血性弧菌的檢測。2.3鹽藻顯色培養(yǎng)基的篩選結(jié)果將副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolytieus)ATCC17802與各非目標弧菌菌液混合,分別將不增菌和增菌的菌液接種于兩種顯色培養(yǎng)基,其靈敏度和生長率試驗結(jié)果如表3和表4所示,結(jié)果顯示對副溶血性弧菌ATCC17802增菌或不增菌,HKMVPM顯色培養(yǎng)基的檢出率稍優(yōu)于KHVPM,但隨著非目標弧菌的濃度升高,會影響副溶血性弧菌的分離;對混合凍干粉,在未增菌情況下,HKMVPM顯色培養(yǎng)基可分離到副溶血性弧菌,而KHVPM則未檢出;在增菌后,兩者均可檢出副溶血性弧菌,但檢出率HKMVPM遠遠高于KHVPM。2.4生化鑒定結(jié)果如表5所示,在檢測的28份海鮮樣品中,HKMVPM和KHVPM以及TCBS平板上的可疑菌落檢出率分別為64.28%、60.71%和82.14%,但經(jīng)生化鑒定確證后的符合率分別為94.44%、94.11%和60.86%。結(jié)果表明,兩種顯色培養(yǎng)基對可疑菌落的檢出率及符合率均沒有顯著差異,可以達到相同的檢測限,且均優(yōu)于TCBS。三種培養(yǎng)基相比,兩種顯色培養(yǎng)基比TCBS具有更高的檢測效率,可減少對較多可疑菌落的生化鑒定。3顯色培養(yǎng)基的發(fā)展對副溶血性弧菌建立起鑒別性顯色快速檢測技術(shù),實現(xiàn)對致病菌的快速檢測,可以大大地降低工作量、節(jié)省人力和物力,因而在食品安全中對提高食品質(zhì)檢質(zhì)控水平和效率具有十分重要的意義。近年來,國外已商品化的顯色培養(yǎng)基,已被許多國家的政府和檢測機構(gòu)采用(包括國內(nèi)食品監(jiān)督檢定所、商檢和疾病預(yù)防控制中心等),應(yīng)用于食品、醫(yī)藥衛(wèi)生和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域,給檢測工作提供了很大方便,但由于成本因素國內(nèi)一般廠家較少使用進口產(chǎn)品。我國已于2008年10月修訂了食品中副溶血性弧菌的標準檢驗方法,顯色培養(yǎng)基首次進入我國的食品衛(wèi)生標準,必將會進一步促進該檢測技術(shù)在全國范圍內(nèi)得到更廣泛的應(yīng)用。目前,國內(nèi)外已有不少應(yīng)用顯色培養(yǎng)基進行副溶血性弧菌分離的文獻報導[5,7,10,11,12,13,14,15,16]。該顯色培養(yǎng)基由同事首先研究開發(fā),但由于在實驗中所用的菌株有限以及其他方面原因,導致其配方還存在一些問題,主要表現(xiàn)在部分目標菌顯色不明顯和檢出率低,并且實際樣品中非目標菌的過分擴散而影響目標菌的檢出。作者就其所存在的缺點對此配方重新進行了優(yōu)化與改良,并應(yīng)用了比文獻更多種類的目標菌和非目標菌以及模擬樣品對該顯色培養(yǎng)基新配方進行了更全面的效果驗證取得了較滿意的實驗結(jié)果。在對混合弧菌的凍干樣品檢測中,副溶血性弧菌經(jīng)過超低溫真空干燥后,細胞受損,活力下降若顯色培養(yǎng)基對受損的細胞復(fù)蘇能力不夠,將導致不能檢出的結(jié)果。本實驗室研究團隊首次研究開發(fā)出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的雙酶底物復(fù)合顯色培養(yǎng)基。本研究發(fā)現(xiàn)顯色培養(yǎng)基對酶的特異性是相對的,某些腸道細菌(如糞腸球菌、腸桿菌等)也含有與副溶血性弧菌相同的β-D-葡萄糖苷酶,在顯色培養(yǎng)基上也會顯示出同樣的色澤,造成對目標菌的干擾;但由于腸桿菌同時含有β-D-半乳糖苷酶,故本顯色培養(yǎng)基的顯色底物是雙酶混合底物,不但含有副溶血性弧菌β-D-葡萄糖苷酶所對應(yīng)的底物,同時還含有腸道