DNA重組技術(shù)的基本工具2

專題1基因工程20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破DNA是遺傳物質(zhì)的證明DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立遺傳密碼的破譯技術(shù)發(fā)明使基因工程的實(shí)施成為可能基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)工具酶的發(fā)明DNA合成和測序技術(shù)的發(fā)明DNA體外重組的實(shí)現(xiàn)重組DNA表達(dá)實(shí)驗的成功第一例轉(zhuǎn)基因動物問世

·PCR技術(shù)的發(fā)明1.1DNA重組技術(shù)的基本工具DNA重組技術(shù)的基本工具準(zhǔn)確切割DNA的工具（“分子手術(shù)刀”）DNA片段的連接工具（“分子縫合針”）基因轉(zhuǎn)移工具（“分子運(yùn)輸車”）基因的大小以納米計算，要對它進(jìn)行剪切、拼接等操作，沒有非常精細(xì)的工具是不行的。進(jìn)行基因操作最少需要以下三種工具：識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。主要是從原核生物中分離純化出來的一種酶。能將外來的DNA切斷，由于這種切割作用是在DNA分子內(nèi)部進(jìn)行的，故名限制性核酸內(nèi)切酶。4000種。1、來源：2、種類：3、作用：4、結(jié)果：形成兩種末端“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶黏性末端平末端

限制酶切割后有兩種不同的結(jié)果，一種產(chǎn)生黏性末端，一種產(chǎn)生平末端。那么恢復(fù)它們的連接時，所用DNA連接酶是否可以不加選擇？E.coliDNA連接酶：連接黏性末端T4DNA連接酶：連接黏性末端和平末端限制酶切割DNA后形成的末端——黏性末端、平末端是如何形成的？大腸桿菌的一種限制酶（EcoRⅠ)能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開形成黏性末端。SmaⅠ能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切割形成平末端。重播什么叫黏性末端？當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線兩側(cè)切開時，被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。什么叫平末端？

當(dāng)限制酶從識別序列的中心軸線處切開時，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端?；虻尼樉€──DNA連接酶切斷的DNA片段要與受體細(xì)胞的DNA連接，你覺得可以用什么酶？DNA聚合酶和DNA連接酶有何相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？T磷酸二酯鍵1234512345ADNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈雙鏈單鏈連接部位在兩DNA片段之間形成磷酸二酯鍵將單個核苷酸加到已存在的核酸片段的3’末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵第二課時基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計，通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ痰膭e名基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)結(jié)果人類需要的基因產(chǎn)物基因工程培育抗蟲棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)重組DNA導(dǎo)入形成一、“分子手術(shù)刀”

——限制性核酸內(nèi)切酶

作用——限制性核酸內(nèi)切酶能識別雙鏈DNA分子的某種特定的核苷酸序列，并在使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。磷酸二酯鍵即脫氧核糖、磷酸之間的連接ATGGCATCTTCGAAGAATTC

CTTAAG中軸線CTTAAGAATTC

GCCCGGG

GGGCCCCCCGGG

GGGCCC黏性末端平末端

大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成，例如，EcoRΙ、SmaΙ，也有少數(shù)有4、5或8個核苷酸組成。大腸桿菌的一種限制酶（EcoRⅠ)能識別GAATTC序列，SmaI識別CCCGGG序列:

原核生物很容易受到自然界中外源DNA的入侵，但是長期的進(jìn)化過程中，這些原核生物卻沒有因為外源DNA的入侵而滅絕。根據(jù)我們剛剛掌握的知識，你能推測這其中的原因嗎？

原核生物細(xì)胞中的限制酶會將外源DNA切割掉，使之失效，以保證自身的安全，但是不會切割自身的DNA，這是原核生物在長期進(jìn)化過程中形成的一套防御機(jī)制。

二、DNA連接酶——“分子縫合針”作用——把兩條DNA末端之間的縫隙“縫合”起來。G

AATTCCTTAA

G

即脫氧核糖、磷酸基之間的連接

GP

APDNA連接酶DNA聚合酶連接DNA鏈雙鏈單鏈連接部位兩DNA片段之間的磷酸二酯鍵將游離的脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來。尋根問底：DNA連接酶和DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

要讓一個從甲生物細(xì)胞內(nèi)取出來的基因在乙生物體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，還得將這個基因送到乙生物的細(xì)胞內(nèi)去！能將外源基因送入細(xì)胞的工具就是載體。質(zhì)粒擬核大腸桿菌細(xì)胞作為載體的必要條件能自我復(fù)制有切割位點(diǎn)能與目的基因結(jié)合能進(jìn)入受體生物細(xì)胞并在受體生物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)；有遺傳標(biāo)記基因?qū)κ荏w細(xì)胞無害比較容易得到基因的運(yùn)輸工具——運(yùn)載體能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，將來可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別?；虻妮d體——“分子運(yùn)輸車”載體必須具備的條件：1、能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；2、具有多個限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；3、具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等）

4、對受體細(xì)胞無害載體的作用：1、將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。2、利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對外源基因進(jìn)行大量復(fù)制。常用的載體有：

質(zhì)粒，λ噬菌體的衍生物，動植物病毒等質(zhì)粒質(zhì)粒是基因工程最常用的運(yùn)載體，它廣泛地存在于細(xì)菌中，是細(xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀DNA分子，大小只有普通細(xì)菌擬核DNA的百分之一。要對天然質(zhì)粒進(jìn)行人工改造基因操作的基本步驟提取目的基因

從供體細(xì)胞的DNA中直接分離基因（如“鳥槍法”）人工合成基因反轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法目的基因是人們所需要轉(zhuǎn)移或改造的基因。如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細(xì)菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。三種目的基因提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因?qū)Ｒ恍?/p>

最強(qiáng)化學(xué)

合成法操作過程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性強(qiáng)反轉(zhuǎn)錄法工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因操作簡便廣泛使用鳥槍法缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)目的基因與運(yùn)載體結(jié)合將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測和表達(dá)

檢測：通過檢測標(biāo)記基因的有無來判斷目的基因是否導(dǎo)入。表達(dá)：通過特定性狀的產(chǎn)生與否來確定目的基因是否表達(dá)。常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等?；虿僮鞯幕静襟E目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法1、將細(xì)菌用CaCl2處理，以增大細(xì)菌細(xì)胞壁的通透性。2、使含有目的基因的重組質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞。3、目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)，隨其繁殖而復(fù)制，由于細(xì)菌繁殖的速度非常快，在很短的時間內(nèi)就能獲得大量的目的基因?；虿僮鞯幕静襟E練習(xí)在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的DNA片段，需使用（）同種限制酶B.兩種限制酶同種連接酶D.兩種連接酶不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制（）

B、有多個限制酶切點(diǎn)

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的步驟是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合

C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞

D、目的基因的檢測和表達(dá)C練習(xí)關(guān)于限制酶的說法中，正確的是（）A、限制酶是一種酶，只識別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中C練習(xí)（多選）有