革蘭氏染色實驗課件

實驗二革蘭氏染色實驗要求堅持課前預習不遲到，不早退，更不能無故缺課嚴格按照正確規(guī)范實驗方法進行實驗，作好記錄保持實驗室整潔注意安全實事求是、獨立完成實驗報告課程導入觀察上次實驗課細菌培養(yǎng)結果菌落觀察：37℃孵育18～24h后觀察1.大小2.形狀3.表面（光滑？濕潤？）4.邊緣（整齊？）5.透明？6.顏色（色素？）手指皮膚細菌菌落形態(tài)教學目標：1.鞏固和掌握顯微鏡油鏡的正確使用2.學習細菌革蘭氏染色的原理和方法3.學會顯微鏡觀察細菌的形態(tài)3.對人體微生物染色檢查，初步建立無菌操作的概念顯微鏡的使用油鏡頭的識別和重要參數(shù)油鏡的工作原理油鏡的使用方法和注意事項油鏡頭的識別和重要參數(shù)放大倍數(shù)數(shù)值口徑工作距離油鏡的工作原理使用油質(zhì)作為玻片與物鏡之間的介質(zhì)——油浸系可以增加顯微鏡的放大倍數(shù)可以增加事業(yè)的照明度可以增加顯微鏡的分辨率油鏡的使用方法和注意事項1.用低倍鏡對光。2.低倍鏡觀察（尋找觀察目標），適當縮小光圈。3.油鏡觀察，低倍鏡找到目標后，物鏡轉(zhuǎn)成八字形，在載玻片上滴加一滴香柏油，直接轉(zhuǎn)至油鏡，調(diào)節(jié)細焦準螺旋，使物象清晰，觀察記錄。最大光圈4.觀察完畢，上升鏡筒，轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換器，使油鏡偏位，用干凈擦鏡紙擦去鏡頭上的油跡，再取一張擦鏡紙滴加2～3滴酒精乙醚擦去鏡頭上殘留的香柏油，最后再用一張干凈擦鏡紙擦去殘留的酒精乙醚。5.將顯微鏡各部分還原，放回。革蘭氏染色——原理1）.細胞壁結構不同G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌保留初染時的顏色。革蘭氏染色——原理

G-菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，使結晶紫和碘的復合物易于滲出，結果細菌就被脫色了，再經(jīng)復染后就倍染成了紅色。對比圖：革蘭氏染色——原理2）.等電點不同G+菌的等電點低（pI2～3），G-菌等電點較高（pI4～5），在相同pH條件下，G+菌所帶的負電荷比G-菌多，與帶正電荷的結晶紫燃料結合較牢固且不易脫色。3）.形成的復合物不同G+菌細胞內(nèi)含有大量核糖核酸鎂鹽，可與結晶紫和碘牢固地結合成大分子復合物，不易被乙醇脫色；而G-菌細胞內(nèi)含極少量的核糖核酸鎂鹽，吸附染料量少，形成的復合物分子也較小，故易被乙醇脫色。實驗材料1.標本：培養(yǎng)18～24h的學生手指皮膚表面細菌；2.染色液和試劑：結晶紫，碘液，95%乙醇，稀釋石碳酸復紅，生理鹽水，香柏油，酒精乙醚；3.器材：載玻片，接種環(huán)，酒精燈，顯微鏡，打火機，擦鏡紙等。革蘭染色——方法與步驟1.制片：1）.涂片：取一潔凈載玻片，按無菌操作方法，接種環(huán)滅菌后取生理鹽水1～2環(huán)于載玻片中央，接種環(huán)再次滅菌，冷卻后選取平板上單個菌落涂于生理鹽水，并用接種環(huán)混合均勻，制成薄涂片。2）.干燥：涂片自然干燥或在酒精燈上方烘干，切忌緊靠火焰，以免標本烤焦，損壞細菌結構，影響鏡檢。3）.固定：手持玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2～3次。（以不燙手為宜）。注意：操作過程中始終貫穿無菌操作觀念，要把生物安全放在心里。在新冠疫情的環(huán)境下，作為醫(yī)學生更應該牢記生物安全。方法與步驟2.染色初染1min媒染1min脫色（結晶紫）水洗（碘液）水洗（95%乙醇）

30s～1min

水洗

自然干燥30s復染觀察水洗（稀釋石碳酸復紅）方法與步驟3.觀察

紫色：G+1）看顏色

紅色：G-

圓形：球菌

2)看形態(tài)

桿形：桿菌

弧形：弧菌結果：G+球菌/G+桿菌/G+弧菌；G-球菌/G-桿菌/G-弧菌。不偽造和編造結果，做人做事實事求是，學術誠信。革蘭氏陽性球菌革蘭氏陰性球菌霍亂弧菌副溶血性弧菌示教學生操作問題總結分析1.涂片過厚，導致結果不易觀察；2.干燥時注意標本烤枯，不要忘記標本固定；3.脫色時間是關鍵；4.菌齡不易太老，以18~24h為宜；5.學生提問，解答。實驗報告姓名、班級和學號實驗題目實驗原理（略寫）實驗操作（略寫）實驗結果——畫圖——文字描述分析和討論