病毒和病毒成份的提純剖析

第十四章病毒和病毒成分的提純一、病毒的提純(一)沉淀法(二)層析法(三)兩相溶劑間分派系數(shù)法(四)紅細(xì)胞吸附法 (五)電泳法(六)超速離心法(七)超濾法二、病毒蛋白亞單位的分離三、病毒脂質(zhì)的抽提四、病毒糖類(lèi)的抽提 一、病毒的提純所謂病毒提純,就是應(yīng)用多個(gè)物理、化學(xué)辦法，以不使病毒受損傷和失活為前提，去除宿主細(xì)胞組分等非病毒雜質(zhì)，提取出高純度濃縮的病毒樣品。病毒提純是病毒學(xué)研究的重要前提，病毒微細(xì)形態(tài)構(gòu)造的研究、病毒抗原蛋白的分離提純、病毒化學(xué)成分及其遺傳物質(zhì)——DNA或RNA的具體研究都需要高純度的病毒樣品。病毒純度只是一種相對(duì)的概念，很難有絕對(duì)的原則，普通下列幾點(diǎn)能夠作為鑒定原則。1.物理均一性測(cè)定病毒樣品的物理均一性,是證明其純度的慣用辦法,涉及電鏡檢查、病毒粒子沉降系數(shù)和擴(kuò)散常數(shù)及其在凝膠電泳、等電聚焦中的遷移率等。2.病毒滴度與蛋白含量的比例測(cè)定病毒材料的感染力或其血清學(xué)反映滴度與其蛋白含量的比例，也是一種普通采用的純度測(cè)定辦法。病毒滴度對(duì)蛋白含量的比例越高,闡明病毒的純度越高。3.免疫學(xué)反映免疫反映單一而無(wú)非特異反映，則闡明病毒材料比較純凈。4.結(jié)晶形成病毒粒子在十分純凈的狀況下，經(jīng)常能夠形成結(jié)晶，但少數(shù)混有雜質(zhì)的病毒樣品亦可形成結(jié)晶，因此這也只是一種相對(duì)原則。病毒提純的重要根據(jù)和條件有:(1)病毒只在活的細(xì)胞內(nèi)寄生、復(fù)制和增殖,要在病毒不失活的前提下，使之從細(xì)胞中釋放出來(lái)，去除細(xì)胞成分。有些病毒如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、披膜病毒,病毒粒子被釋放到細(xì)胞外，能夠從培養(yǎng)液或尿囊液中提純；而另某些病毒如腺病毒、乳多空病毒、小DNA病毒，在毒粒成熟后只有少數(shù)病毒釋放到細(xì)胞外，大量提純時(shí)必須首先裂解細(xì)胞，使病毒大量釋放。實(shí)驗(yàn)室慣用凍融、研磨、高速搗碎、超聲波解決或高壓沖擊、中性去污劑裂解、蛋白酶解等物理和化學(xué)的辦法。通過(guò)這些辦法解決獲得的粗制的病毒懸液，其中常含有大量的細(xì)胞碎片，一種有效的辦法是以～6000r/min離心30～40分鐘，可除去90％以上的細(xì)胞碎片和雜質(zhì)。(2)病毒粒子事實(shí)上是大的蛋白顆粒，能夠應(yīng)用提純蛋白質(zhì)的某些技術(shù)辦法。(3)對(duì)大小、形狀和密度高度一致的病毒粒子,能夠采用分級(jí)分離的技術(shù)。固然不同的病毒，其生長(zhǎng)特性及理化學(xué)性質(zhì)不同，因此提純辦法也不盡一致。(一)沉淀法重要是從稀的懸浮液中濃縮病毒，有中性鹽沉淀法、聚乙二醇(PEG)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法、皂土法和魚(yú)精蛋白沉淀法等。1.中性鹽沉淀法病毒普通在45%以上飽和度的硫酸銨溶液中沉淀，且保持其感染性。在含有病毒的組織培養(yǎng)液中加入等體積的飽和硫酸銨，能夠很容易地沉淀某些病毒如狂犬病毒、雞新城疫病毒等。2.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇(PEG)為水溶性非離子型聚合物，含有多個(gè)不同的分子量，用于病毒沉的重要是分子量為～6000的PEG。將PEG配成50%左右的溶液，或直接將固體PEG加于毒懸液中,使其達(dá)成所需濃度,普通在4℃攪拌過(guò)夜，然后離心使病毒沉淀。Tanncock(1985年)成功地用PEG濃縮了禽腦脊髓炎病毒。3.有機(jī)溶劑沉淀法甲醇、氯仿、正丁醇、氟碳化合物等都可用于提純病毒，但乙醚、氯仿等脂溶劑對(duì)于含有脂質(zhì)囊膜的病毒含有破壞和滅活作用，故不適于這類(lèi)病毒的濃縮提純。4.等電點(diǎn)沉淀法病毒粒子在等電點(diǎn)時(shí)，所攜帶的正電荷與負(fù)電荷互相中和，因而失去互相排斥的作用而發(fā)生沉淀。多數(shù)病毒的等電點(diǎn)在pH4.5～5.5之間，因此在pH3～6范疇內(nèi)均可沉淀，由于一部分細(xì)胞成分在等電點(diǎn)時(shí)亦發(fā)生沉淀，此法效果不太抱負(fù)，但從感染的組織培養(yǎng)液中濃縮病毒，能夠獲得較好成果。應(yīng)用酸性范疇的等電點(diǎn)沉淀或分級(jí)沉淀病毒時(shí)，必須注意pH對(duì)病毒活性的影響及病毒粒子電荷與組織蛋白電荷的差別。5.皂土法Girin(1989年)應(yīng)用皂土在酸性條件下(pH4～4.5)吸附輪狀病毒SA-11，再在堿性條件下（pH8.5），又使其洗脫下來(lái),從而達(dá)成純化目的。6.魚(yú)精蛋白沉淀法魚(yú)精蛋白為堿性蛋白，含有攜帶其它蛋白質(zhì)共沉淀的作用，能和直徑不不大于50nm的病毒共同沉淀而不影響病毒的感染力。當(dāng)向這種沉淀物加入1mol/LNaCl時(shí),病毒又重新釋放到懸液中，而魚(yú)精蛋白仍然沉淀。直徑不大于50nm的小型病毒則不與魚(yú)精蛋白共同沉淀。因此，可運(yùn)用魚(yú)精蛋白去除病毒材料中直徑不不大于50nm的異種蛋白質(zhì)。(二)層析法病毒粒子表面攜帶特定的電荷群，因此病毒對(duì)離子交換樹(shù)脂及類(lèi)似的其它吸附劑含有親和性。運(yùn)用吸附劑的層析法分為兩種，一種是正吸附法，即根據(jù)病毒粒子表面所攜帶的電荷進(jìn)行特異性吸附，然后用適宜濃度的離子溶液將病毒粒子解離回收；另一種是負(fù)吸附法，即只吸附組織或宿主細(xì)胞成分等非病毒蛋白，而讓病毒粒子通過(guò)。收集濾液后經(jīng)差速離心沉淀法回收病毒。由于多個(gè)病毒的大小和表面構(gòu)造等理化性質(zhì)不同，因此對(duì)吸附劑的親和性也有明顯的差別。1.萄聚糖柱層析法將初步濃縮的材料，通過(guò)葡聚糖G-150或G-200柱層析，然后用0.02～0.15mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.6)洗脫，分部收集，測(cè)定280nm波優(yōu)點(diǎn)的OD值，將含病毒的各部分相混合，再濃縮，透析之后，即可得到比較純凈的病毒，Nagano(1989年)用Sephacryls-1000柱層析純化了雞傳染性支氣管炎病毒。2.凝膠層析法①磷酸鈣凝膠:這是病毒吸附層析法中較為慣用的凝膠，由0.5mol/LCaCl2和0.5mol/LNa2HPO4溶液混合制備凝膠狀沉淀物。在中性條件下生成的凝膠稱(chēng)為“brushite”，在堿性條件下生成的凝膠稱(chēng)為羥基磷灰石(hydroxypatite)。兩者均用0.001mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮，置于4℃4～5天，使它充足沉淀后應(yīng)用。②氫氧化鋅凝膠:是由7mol/L氨水與0.1mol/L醋酸鋅溶液滴加混合(pH8.5)而制備的，在制備后數(shù)小時(shí)內(nèi)較穩(wěn)定，可作為吸附劑。Newton和Beris等將水泡性口炎病毒懸液與氫氧化鋅凝膠混合，使其形成復(fù)合體后沉淀，然后用0.08mol/LEDTA(pH8.5)解離病毒，獲得較好的回收量。③焦磷酸鎂凝膠:是由0.1mol/L焦磷酸鈉和0.1mol/Lmol/MgCl2，以2：10(體積)比例在室溫中緩慢滴加混合而獲得的較穩(wěn)定的焦磷酸鎂凝膠。西村等將牛痘病毒懸液同此凝膠混合，使病毒吸附于凝膠，然后用0.1mol/L鹽水洗2次，最后用0.3mol/L枸櫞酸鈉溶液解離病毒，將病毒較好地回收于水相中。3.離子交換纖維素柱層析法離子交換層析適于分離幾乎全部帶電荷的分子。普通有陰離子交換劑和陽(yáng)離子交換劑兩種。某些病毒能夠被離子交換劑經(jīng)離子鍵作用而吸附，通過(guò)變化平衡液的離子強(qiáng)度,使其再洗脫下來(lái)而達(dá)成純化目的。腺病毒和口蹄疫病毒被DEAE纖維素吸附，可分別再用0.5mol/L和0.15mol/LNaCl溶液洗脫下來(lái)，從而得以純化。4.親和層析法親和層析是一種特殊的吸附層析,基質(zhì)與待分離物含有特異的生物親和力。普通是將特異的抗體經(jīng)共價(jià)偶聯(lián)作用結(jié)合在配基上構(gòu)成一種不溶性配基。當(dāng)對(duì)應(yīng)的抗原物質(zhì)通過(guò)固定配基裝成的層析柱時(shí)，即被吸附。隨即再變化實(shí)驗(yàn)條件，將其洗脫下來(lái)，達(dá)成純化的目的。該法是于80年代早期開(kāi)始用于病毒的分離提純，不僅純度好，敏感，并且回收率高。Njayou(1991年)應(yīng)用此法成功地提純了麻疹病毒。他們應(yīng)用猴抗麻疹病毒的IgG進(jìn)行共價(jià)偶聯(lián)，獲得了高純度而有活性的病毒，回收率可達(dá)總回收成分的30％。Rimmelzwaan(1987年)應(yīng)用犬細(xì)小病毒的中和性單克隆抗體親和層析，純化了細(xì)小病毒，經(jīng)SDS—PAGE和ELISA鑒定，99％以上的雜蛋白被洗除，收獲了70～90％的病毒抗原成分。(三)兩相溶劑間分派系數(shù)法該法重要原理就是高分子物質(zhì)以溶質(zhì)形式存在于兩相溶劑中，根據(jù)其分派系數(shù)的不同而選擇性地分派于其中的一方，從而達(dá)成純化的目的。所采用的溶劑重要有:葡聚糖硫酸鹽(DextranSulphate,DS)和聚乙二醇(PEG)或甲基纖維素(MC)和聚乙烯醇(PVA)，形成Ds—PEG系、Ds—PVA系和Ds—MC系。運(yùn)用病毒在有機(jī)溶劑中的分派原理，在適宜的溶劑系統(tǒng)和葡聚糖層之間進(jìn)行多次重復(fù)轉(zhuǎn)換，不僅能夠濃縮病毒，并且還能夠純化病毒。普通是將兩相溶劑如Ds—PEG以適宜的重量比例混合，然后加入病毒液，多次激烈振蕩混合，置于4℃24～36小時(shí)，即可分離為兩層，病毒將特異地分布于其中一方(如Ds層中)。適宜變化溶劑的混合比例時(shí)，分派于Ds層中的病毒可由Ds層轉(zhuǎn)入PEG中，而得以濃縮。若調(diào)節(jié)適宜，一步就可濃縮100倍，兩步濃縮就能夠達(dá)成10000倍。非病毒物質(zhì)普通以不同的方式進(jìn)行分派，從而達(dá)成濃縮純化的目的。Nammar(1991年)應(yīng)用Ds—PVA系純化了反轉(zhuǎn)錄病毒。兩相溶劑間分派系數(shù)法簡(jiǎn)樸、溫和，并能使病毒得到較高的濃縮和純化。但是為了獲得高度純化的病毒，還需配合應(yīng)用其它辦法。(四)紅細(xì)胞吸附法所謂病毒的紅細(xì)胞凝集反映，就是指病毒被紅細(xì)胞表面粘蛋白吸附的現(xiàn)象。自Hirst發(fā)現(xiàn)流感病毒的紅細(xì)胞凝集性質(zhì)以來(lái)，隨即相繼發(fā)現(xiàn)其它某些動(dòng)物病毒也有紅細(xì)胞凝集性。Stanley證明，流感病毒在0℃時(shí)被紅細(xì)胞吸附，而在37℃時(shí)卻從紅細(xì)胞上脫離下來(lái)的性質(zhì)，從而將此辦法應(yīng)用于病毒提純。我們實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用醛化雞紅細(xì)胞吸附馬流感病毒，獲得較好效果。具體辦法是:采用雞血，以無(wú)菌生理鹽水洗滌3次后制成壓積紅細(xì)胞。另取福爾馬林和生理鹽水等量混合，制成福爾馬林鹽水。在2份福爾馬林鹽水中加入1份壓積紅細(xì)胞，充足振蕩15min，置2～8℃冰箱內(nèi)48h，每天振蕩2～3次。屆時(shí)取出，再振蕩1次，后用700r/min離心5～10min，棄上清，再加20倍量生理鹽水，振蕩混合后置2～8℃冰箱過(guò)夜。棄上清，加入20倍量生理鹽水，如上洗滌3次。取沉淀紅細(xì)胞，加入相稱(chēng)于初次壓積紅細(xì)胞量的生理鹽水，混勻后即可應(yīng)用。將馬流感病毒感染的雞胚尿囊液，作2500r/min離心10min，吸取上清液。取保存于2～8℃的病毒液100ml，加入2～8℃的醛化紅細(xì)胞懸液6ml，充足振蕩15min，立刻放入冰箱內(nèi)每2h振蕩1次，共2～3次，隨即置冰箱中過(guò)夜，待其自然沉淀。次日吸出上清，如其血凝價(jià)在1:15下列，則證明已經(jīng)充足吸附，此時(shí)即可進(jìn)行釋放，否則需再補(bǔ)加醛化紅細(xì)胞懸液繼續(xù)吸附。在已充足吸附病毒的醛化紅細(xì)胞沉淀中，加入相稱(chēng)于原病毒液1/10量的5mol/LNaCl溶液,充足振蕩，置37℃水浴中4h，每隔30～60min振蕩1次。取出后立刻以700r/min離心10min。吸取上清液，即為濃縮病毒液，必要時(shí)可對(duì)已釋放過(guò)病毒的醛化紅細(xì)胞作第二次釋放，辦法同前。上述吸附-釋放辦法，可將病毒濃度提高10倍左右(以血凝效價(jià)表達(dá))。(五)電泳法先將病毒懸液對(duì)緩沖液透析。根據(jù)病毒的種類(lèi)不同，選擇適宜的緩沖液，但離子強(qiáng)度不能超出0.3mol/L以上。病毒粒子根據(jù)其所攜帶的電荷，在電場(chǎng)中或向正極，或向負(fù)極移動(dòng)，因此電泳結(jié)束后，分段收集病毒區(qū)帶部分，就能達(dá)成提純的目的。(六)超速離心法病毒粒子通過(guò)初步濃縮之后，要進(jìn)一步純化，普通采用超速離心法，它是分離提純不同大小的病毒的有效辦法之一。在應(yīng)用超速離心法沉淀病毒時(shí)，必須理解所用離心機(jī)的離心力。離心機(jī)由于轉(zhuǎn)頭的回轉(zhuǎn)產(chǎn)生了強(qiáng)大的離心力,這種離心力是隨轉(zhuǎn)頭的大小和離心管至轉(zhuǎn)軸中心的距離而變化的。高速和超速離心機(jī)的離心條件，有的以每分鐘速度(r/min)表達(dá)，有的則以離心力——重力加速度g.(980cm/S2)為單位來(lái)表達(dá)。離心沉淀時(shí)，沉降速度與離心力有關(guān)。離心機(jī)轉(zhuǎn)速在4000r/min左右的稱(chēng)為低速(普通)離心機(jī)；轉(zhuǎn)速至25000r/min左右的稱(chēng)為高速離心機(jī)；轉(zhuǎn)速25000r/min以上的稱(chēng)為超速離心機(jī)。高速和超速離心機(jī)裝有冷凍裝置和抽真空裝置，以保持離心腔中恒定的低溫，并減少轉(zhuǎn)頭運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)空氣的摩擦力。超速離心機(jī)有制備和分析用兩類(lèi)，近來(lái)又生產(chǎn)出制備、分析及區(qū)帶持續(xù)離心三用裝置在一起的離心機(jī)，有的還帶掃描裝置。使用超速離心機(jī)的分離提純辦法有三種:(1)差速離心法；(2)速度區(qū)帶離心法；(3)平衡密度梯度離心法(或等密度梯度離心法)。1.差速離心法這是應(yīng)用較早的簡(jiǎn)樸辦法，建立在不同大小和比重的粒子在沉降速度上存在差別的基礎(chǔ)上。具體做法是將被分離的樣品交替進(jìn)行低速離心與高速(或超速)離心。沉降速度差別在一種或幾個(gè)數(shù)量級(jí)的粒子，可用本法分離提取。粒子大小、轉(zhuǎn)速與離心沉淀時(shí)間的關(guān)系，差速離心合用于從組織培養(yǎng)液、雞胚尿囊液或通過(guò)紅細(xì)胞吸附-釋放的病毒懸液中提純病毒。在由感染細(xì)胞或組織勻漿中提取病毒時(shí)，由于與病毒大小相近的細(xì)胞亞單位及碎片的存在，提純效果不抱負(fù)。差速離心法的優(yōu)點(diǎn)是能快速解決大量樣品，故常作為病毒精制的第一種階段，或者用于病毒樣品的濃縮和粗提。以差速離心法分離提純病毒時(shí)，經(jīng)常以低速(～3000r/min，20～30min)及中速(10000r/min，20～30min)去除較大的宿主細(xì)胞碎片、污染的細(xì)菌及其它較大的雜質(zhì)。然后，選擇在60min內(nèi)能夠沉淀80%以上的病毒粒子的較高速度，離心1～2h，使病毒沉淀。對(duì)中、大型病毒如流行性感冒病毒，在經(jīng)紅細(xì)胞吸附-釋放后，于25000r/min離心60min，即可達(dá)成目的。小型病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒、披膜病毒，則需以35000～45000r/min離心1～2h。高速或超速離心沉淀物，可用研磨和超聲波振蕩等辦法打碎后懸浮于緩沖液中。對(duì)于非病毒雜質(zhì)較多的樣品進(jìn)行差速離心，由于病毒對(duì)沉淀物的非特異性吸附而有較多損失。2.速度區(qū)帶離心法是根據(jù)被分離物質(zhì)在強(qiáng)大離心力中沉降速度不同而進(jìn)行的分離辦法。該法使用的介質(zhì)密度應(yīng)當(dāng)不大于被分離物質(zhì)的密度。介質(zhì)可覺(jué)得均一密度，也可覺(jué)得梯度密度。當(dāng)被分離的物質(zhì)沉降到與介質(zhì)密度相等的區(qū)域時(shí)就不再沉降。不同分子形成不同的區(qū)帶，而稱(chēng)為速度區(qū)帶。該法規(guī)定樣品濃度為頂端濃度梯度的1/10，樣品體積為離心管體積的5%。慣用的介質(zhì)有蔗糖、甘油、聚蔗糖等。在病毒純化時(shí)，將病毒樣品溶液層加于密度梯度層的頂部，借助病毒粒子或其亞單位成分本身的浮密度差別，在離心力作用下降到密度相等的介質(zhì)層內(nèi)，最后排列成帶狀停留不動(dòng)。密度較小的粒子或成分停留在上面的幾層內(nèi)，密度較大的粒子或成分沉降于下面幾層內(nèi)。應(yīng)用密度梯度法，能夠獲得相稱(chēng)純凈的病毒樣品。病毒粒子或成分的沉降速度取決于其大小、形狀及比重，也取決于離心力及懸液介質(zhì)的密度和粘度。蔗糖是生物大分子粒子密度梯度分離時(shí)最常應(yīng)用的材料，因其易溶于水，且對(duì)核酸及蛋白質(zhì)呈化學(xué)惰性。慣用的梯度范疇從5～20%或10～60%。除蔗糖濃度持續(xù)梯度離心外，近來(lái)有人在兩層濃度梯度上層加病毒濃縮樣品，經(jīng)超速離心后將病毒收集于兩層界面處；也有人在單層蔗糖濃度溶液上層加病毒濃縮樣品，經(jīng)超速離心，使病毒沉淀于蔗糖溶液底部。這兩種辦法比較簡(jiǎn)樸，但濃縮提純的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如多層持續(xù)梯度法。3.平衡密度梯度離心法平衡密度梯度離心法是根據(jù)粒子的浮密度不同而加以分離。所謂浮密度就是物質(zhì)的質(zhì)量減去在一定介質(zhì)中所受的浮力,亦稱(chēng)有效密度。制備梯度的辦法有兩種：一種是在飽和的CsCl溶液上面層加病毒樣品(容量比1:4)；另一種是將病毒樣品與CsCl濃溶液均勻地混合。普通用水平轉(zhuǎn)頭，經(jīng)較長(zhǎng)時(shí)間的超速離心，在離心管中形成CsCl的濃度梯度，并由于離心力的作用，樣品中的病毒粒子分布于對(duì)應(yīng)密度的區(qū)域內(nèi)。這種辦法在分析離心中是最慣用的。應(yīng)用本法時(shí)，離心轉(zhuǎn)頭的回轉(zhuǎn)數(shù)越高，離心時(shí)間越長(zhǎng)，越能靠近平衡狀態(tài)。平衡密度梯度離心法廣泛應(yīng)用于病毒和核酸的提純上。用平衡密度梯度離心法提純的動(dòng)物病毒有多型瘤病毒、牛痘病毒、乙型腦炎病毒、狂犬病病毒和馬傳貧病毒等。有的病毒在這些無(wú)機(jī)鹽類(lèi)溶液中被破壞，可加入0.2～0.5%牛血清白蛋白，或用0.5～3.0%甲醛先將病毒粒子固定，然后進(jìn)行平衡密度梯度離心，常能較好地回收病毒。大多數(shù)病毒的浮密度在1.10～1.40范疇內(nèi)。因此制備密度范疇為1.0～1.7的懸浮介質(zhì)，便可滿(mǎn)足大多數(shù)病毒密度梯度離心的需要。4.密度梯度離心法的操作程序(1)密度梯度的制備:制備密度梯度的辦法有不持續(xù)的(即人工操作)和持續(xù)的(即機(jī)械操作)密度梯度兩種。不持續(xù)的或分層的密度梯度的制備不持續(xù)的密度梯度是以人工操作法制備的，在一定溫度下(普通在20℃或在25℃)配制一系列濃度差為5%的梯度溶液,例如蔗糖可配制成5、10、15、20、25、30、35、40%(W/V)等溶液(用蒸餾水或適宜的緩沖液配制)，用皮下注射器或微量吸管，小心地先吸取濃度最大的溶液注入離心管底，然后依次加入較低的各個(gè)濃度(40%→5%)，一層覆蓋著一層地層加于離心管中，注意避免產(chǎn)憤怒泡。如果各層界面被沖動(dòng)破壞，則應(yīng)重新制備。也能夠?qū)㈤L(zhǎng)針頭插入管底，依次從濃度低到高加入各溶液。持續(xù)的密度梯度的制備為了產(chǎn)生一種持續(xù)的密度梯度，慣用梯度混合裝置來(lái)制備梯度。梯度混合裝置由A和B管構(gòu)成。兩管之間用雙通活塞聯(lián)結(jié)。在活塞關(guān)閉的狀態(tài)下，向A管中加入低濃度蔗糖溶液，向B管中加入高濃度的蔗糖溶液，兩管中容量要相等。在B管出口處用一根聚乙烯小管連接到離心管。在給B管充液時(shí)，可將聚乙烯小管的流出口向上轉(zhuǎn)動(dòng)，使之超出液體的水平面，從而制止液體流出。充液后可將小管接到離心管中使之貼著管壁，然后開(kāi)動(dòng)小攪拌器，使攪拌棒轉(zhuǎn)動(dòng)，同時(shí)打開(kāi)兩管間活塞。這三個(gè)操作要同時(shí)進(jìn)行，以確保梯度的持續(xù)性。當(dāng)梯度液體自B管流出時(shí)不允許移動(dòng)離心管，待離心管中所盛的梯度溶液的體積達(dá)成需要量之后，將離心管小心地靜止于4℃1～2h，以平衡之?，F(xiàn)在不少“制備用超速離心機(jī)”攜帶有“密度梯度制備自動(dòng)裝置”。按照這個(gè)辦法制備的蔗糖濃度梯度，理論上按公式計(jì)算。這些濃度梯度是根據(jù)樣品和實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩鴮?zhuān)門(mén)選用的。普通使用的濃度梯度范疇為20%→5%，40%→10%，或60%→10%等。(2)加入樣品:用如上所述注射器或微量吸管吸取懸浮于適宜緩沖液中的病毒或核酸樣品(約梯度介質(zhì)體積的1/10容量)，從液面上方1mm處，緊貼著離心管壁輕輕層加于梯度介質(zhì)面上。(3)高速或超速離心:將加入樣品的離心管裝入套管內(nèi)，也可將離心管置于轉(zhuǎn)頭的套管內(nèi)，以免在裝進(jìn)套管時(shí)震動(dòng)液體。擰緊套管螺帽，將套管吊在水平轉(zhuǎn)頭上，置于離心機(jī)內(nèi)。梯度離心普通用高速或超速離心機(jī)。離心速度和時(shí)間，根據(jù)所分離的樣品選定。離心開(kāi)始，樣品中多個(gè)粒子逐步分離，分布于對(duì)應(yīng)的密度梯度層中成為帶狀(如為透明的聚碳酸酯離心管，則能夠清晰地見(jiàn)到帶狀分離，并拍照)。離心時(shí)間屆時(shí)，使離心機(jī)自然停止，不許制動(dòng)，以免破壞梯度。(4)梯度的分段收集(取樣):在離心完了后來(lái)，為了把已分離物質(zhì)的各條帶分開(kāi)，必須取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集辦法有以下幾個(gè)。①取代法：從離心管底部穿刺或?qū)чL(zhǎng)針頭的注射器插入離心管底，使一種稠密的介質(zhì)，如60～70%(W/V)蔗糖溶液，緩慢地注入于離心管底部。然后用一種注射器或移液管，從上面逐個(gè)移出各部分?；蛘咴陔x心管的頸部加上一種塞子，這個(gè)塞子附著一根收集導(dǎo)管，通向一種部分收集器，收取各部分。②穿刺法：將離心管固定于特制的固定架上，在其底部裝上一種垂直向上的空心針穿刺，使梯度溶液自由滴出，可用部分收集器或用小試管分段收集。超速離心機(jī)普通都帶有此裝置。此裝置的缺點(diǎn)是離心管在用一次后即廢棄。③虹吸法：此法的優(yōu)點(diǎn)是不必穿刺離心管，離心管可重復(fù)使用。經(jīng)我們多次實(shí)驗(yàn)，此法簡(jiǎn)便易行，對(duì)梯度密度無(wú)破壞。用一根大穿刺針截兩段做虹吸管，以接上50～100ml玻璃注射器進(jìn)行送氣的辦法，分段收集梯度溶液。④注射器吸取法：用彎曲的針頭(J狀)接在注射器上，從梯度最上層開(kāi)始向下逐級(jí)小心吸取液體。5.梯度各層液體的密度測(cè)定(1)稱(chēng)重量法：用10ul微量注射器吸取樣品，加入于已知重量的毛細(xì)管中，在1/10萬(wàn)分析天秤上稱(chēng)重，計(jì)算重量(g/ml)，即為梯度溶液的密度。(2)測(cè)定折射率法：用阿貝氏折光儀測(cè)定各梯度層溶液的折射率(25℃)。(3)浮漂法：向已制備好的多個(gè)密度溶液中滴入一滴樣品，找出對(duì)應(yīng)的樣品浮密度溶液，即為該梯度層的密度。6.各梯度分層液中病毒分布的鑒定(1)以紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)和核酸吸取峰。吸取各層梯度溶液，用蒸餾水或緩沖液適宜稀釋后，測(cè)定波長(zhǎng)280和260nm的OD值。然后以各梯度層管號(hào)為橫坐標(biāo)，其OD值為縱坐標(biāo)畫(huà)曲線(xiàn)，即為各梯度層中蛋白質(zhì)-病毒含量圖，有些病毒260nmOD值較高。(2)以多個(gè)血清學(xué)辦法測(cè)定各梯度層中病毒的抗原效價(jià)或用組織培養(yǎng)法測(cè)定病毒滴度，證明病毒分布區(qū)域。(3)用電子顯微鏡負(fù)染法觀(guān)察病毒粒子及其純度。將各梯度層樣品裝入透析袋中，置于適宜的溶液中透析去鹽，然后取一滴樣品用蒸餾水稀釋?zhuān)胃接阢~網(wǎng)膜上，用磷鎢酸負(fù)染后電鏡下觀(guān)察病毒粒子。(七)超濾法超濾法是運(yùn)用超濾膜將水、鹽及小分子濾過(guò)，將一定大小的大分子或病毒等顆粒截住從而使后者得到濃縮的一種辦法。超濾膜的孔徑有多個(gè)，可根據(jù)被截留的分子大小而選擇。超濾法是濃縮大容量的病毒樣品的一種非常有效的辦法，其優(yōu)點(diǎn)是能夠在室溫或低溫下操作；對(duì)被濃縮的產(chǎn)物損害很小；濃縮的同時(shí)可達(dá)成部分純化；如選擇適宜的膜和操作參數(shù)，可達(dá)成很高的回收率；另外，超濾系統(tǒng)可密封以避免外來(lái)污染。超濾系統(tǒng)現(xiàn)在重要有三種，即攪拌池式，淺道流動(dòng)系統(tǒng)和中空纖維系統(tǒng)。攪拌池式是一種最簡(jiǎn)樸的超濾系統(tǒng)，由超濾室及磁力攪拌器構(gòu)成，通過(guò)正壓而使液體通過(guò)濾膜。此辦法簡(jiǎn)樸，但濃縮樣品量有限，普通在ml以?xún)?nèi)，并且濾膜孔易于堵塞。淺道流動(dòng)系統(tǒng)的特點(diǎn)是液體在膜表面的螺旋形淺道中流動(dòng)，液體與膜的接觸面積也不不大于攪拌池系統(tǒng)，因而濾過(guò)速度大為提高。中空纖維系統(tǒng)是由諸多根空心纖維成束裝配而成，每根纖維即為一種微細(xì)管型膜，因此，其有效的膜面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)不不大于前二個(gè)系統(tǒng)，濾過(guò)速度很快，合用于大致積的濃縮。二、病毒蛋白亞單位的分離病毒含有幾個(gè)以上的蛋白質(zhì),每一種蛋白質(zhì)普通都由分子量較小的許多相似的亞單位構(gòu)成。病毒的構(gòu)造蛋白決定著病毒粒子的構(gòu)造及其與細(xì)胞受體部位結(jié)合的特異性。病毒的血清學(xué)特異性和酶活性也決定于蛋白質(zhì)。構(gòu)造蛋白尚有保護(hù)病毒核酸的作用——核酸處在蛋白外殼的內(nèi)部，或與蛋白質(zhì)互相纏繞而成核蛋白。因此病毒基因組受到有關(guān)蛋白質(zhì)的保護(hù)，從而能夠抵抗理化學(xué)因素的降解作用。蛋白質(zhì)構(gòu)成病毒質(zhì)量的大部分，病毒粒子內(nèi)的蛋白質(zhì)能夠單獨(dú)地或與糖、脂類(lèi)結(jié)合在一起，成為糖蛋白或脂蛋白。病毒構(gòu)造蛋白能夠從提純的病毒制品中通過(guò)與核酸和其它蛋白分離,而又不打斷肽鍵的解決辦法得到。分離時(shí)須用中性去污劑、極性試劑或制止蛋白聚合的保護(hù)劑如尿素、鹽酸胍、去氧膽酸鈉和SDS等,或變化pH值等辦法加以解決。三、病毒脂質(zhì)的抽提病毒中有許多個(gè)脂類(lèi)化合物，涉及磷脂、中性脂肪、脂肪酸、脂肪醛及膽固醇等。病毒脂質(zhì)的重要成分是磷脂，它在許多病毒中含有構(gòu)造上的功效。病毒的磷脂就在囊膜中，它對(duì)病毒顆粒的構(gòu)造完整性是很重要的。這是由于當(dāng)這類(lèi)病毒用脂溶劑或某些磷脂酶解決后就明顯地喪失了感染性。病毒脂質(zhì)大部分來(lái)源于感染前就存在于宿主細(xì)胞的脂質(zhì)。病毒的有些脂質(zhì)與糖結(jié)合形成糖脂，有些脂質(zhì)與蛋白結(jié)合形成脂蛋白。抽提病毒脂類(lèi)時(shí)最慣用的溶劑系統(tǒng)是氯仿－甲醇。有人應(yīng)用此溶劑系統(tǒng)抽提SV5的病毒脂質(zhì),其辦法是:(1)取凍干的病毒樣品,用氯仿：甲醇：水=65：25：5的溶劑,在室溫下抽提二次,每次20min,接著在氮?dú)庀掠梅序v的溶劑抽提一次20min。(2)合并抽提物,加入其1/6體積的水,混合后分為水相和有機(jī)相。如存在神經(jīng)節(jié)甙脂,則進(jìn)入到水相中,而其它全部脂質(zhì)仍留在有機(jī)相中。(3)將這一部分溶劑移到旋轉(zhuǎn)器或蒸發(fā)器中,在氮?dú)庀买?qū)除有機(jī)溶劑,即獲得總的脂質(zhì)。四、病毒糖類(lèi)的提取糖是全部病