搞定慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)常見問題解決以及實(shí)驗(yàn)技巧分享你只要這么做

導(dǎo)讀：慢病毒滴度單位如何換算？如何擬定慢病毒MOI值？慢病毒感染效率低怎么破？細(xì)胞一添加慢病毒就死亡，是什么狀況？感染預(yù)實(shí)驗(yàn)非做不可？好啦好啦，有關(guān)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的這些那些問題我們將一一為您解答，助您輕松搞定慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)！一、如何添加最優(yōu)化的慢病毒量？擬定靶細(xì)胞MOI值不管是對(duì)活體還是體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，慢病毒體現(xiàn)載體對(duì)遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率至關(guān)重要。慢病毒最早來源于人免疫缺點(diǎn)病毒(HIV)或貓免疫缺點(diǎn)病毒（FIV），能夠感染幾乎全部類型的細(xì)胞，涉及難以用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染甚至無法用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。許多客戶對(duì)如何用慢病毒顆粒進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)持有疑問，特別是對(duì)如何選擇適合的慢病毒量感到困惑。這個(gè)問題可根據(jù)擬定細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)（MultiplicityofInfectionMOI）來解決。滴度與MOI？TU/mL是現(xiàn)在使用最廣泛的慢病毒顆粒滴度單位，「TU」為「TransductionUnits」的縮寫，表達(dá)可成功轉(zhuǎn)導(dǎo)目的細(xì)胞的基因組數(shù)。選購(gòu)慢病毒顆粒之前，首先需理解目的細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)：MOI。MOI的概念很簡(jiǎn)樸，可有效感染細(xì)胞的慢病毒顆粒數(shù)與被感染細(xì)胞數(shù)的比值即為該細(xì)胞的MOI值。例如，應(yīng)用106TU慢病毒感染106個(gè)細(xì)胞可成功使80%以上細(xì)胞達(dá)成轉(zhuǎn)導(dǎo)目的時(shí)，MOI=1；如需要以5×106TU病毒才可成功感染106個(gè)細(xì)胞，則MOI=5。（TU/mL為慢病毒滴度單位，TU表達(dá)有活性的慢病毒量）如何擬定目的細(xì)胞的MOI值?慢病毒對(duì)不同類型細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率各不相似，因此MOI也各異。在此，我們列出了多個(gè)慣用細(xì)胞系的MOI，助您選購(gòu)適宜的慢病毒量。下表是GeneCopoeia通過實(shí)驗(yàn)探索得出的多個(gè)細(xì)胞系的MOI參考值。理解慢病毒滴度是獲得最佳MOI的前提條件。根據(jù)上表，若您的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，其最佳MOI參考值=2，那么當(dāng)您購(gòu)置了50μL的慢病毒顆粒（滴度是108TU/mL）時(shí)，您得到的慢病毒總量為5×106TU。在MOI=2的條件下，您所購(gòu)置的慢病毒足夠轉(zhuǎn)導(dǎo)MCF-7在24孔板中鋪板培養(yǎng)的其中5孔（約合4×105細(xì)胞/孔）。若您的目的細(xì)胞系MOI規(guī)定較高，您需要購(gòu)置或自行包裝更多慢病毒顆粒。請(qǐng)注意：上表所示的MOI值僅供您選購(gòu)慢病毒時(shí)作為用量參考。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)、操作手法等的差別，實(shí)際數(shù)據(jù)可能有輕微浮動(dòng)。因此當(dāng)您收到所購(gòu)置的慢病毒時(shí)，我們?nèi)匀唤ㄗh您通過設(shè)計(jì)梯度MOI感染小量細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（如：MOI=0.313510etc.）檢測(cè)目的細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，確認(rèn)其MOI值。另外，若您的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞未被列在上表中，梯度實(shí)驗(yàn)擬定最佳MOI是至關(guān)重要，甚至必不可少的。您可將病毒進(jìn)行梯度稀釋，分別感染等量的細(xì)胞（見圖1）。圖1.梯度稀釋慢病毒顆粒，探索細(xì)胞最佳MOI值進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的1天前，于96孔板鋪板培養(yǎng)目的細(xì)胞(實(shí)例中使用了H1299細(xì)胞)；在進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天，以10倍梯度稀釋慢病毒并分別進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)；轉(zhuǎn)導(dǎo)72小時(shí)后以熒光顯微鏡觀察GFP報(bào)告基因體現(xiàn)狀況，擬定該細(xì)胞在最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)效果下的慢病毒量。最后，若您的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞規(guī)定較高的MOI值您還可通過下列幾個(gè)辦法將其減少。辦法一是加入polybrene(hexadimethrinebromide)一種能夠減少病毒與細(xì)胞膜間電荷排斥作用的陽(yáng)離子聚合物。另一種辦法是使用能夠捕獲慢病毒顆粒的磁珠（例如，運(yùn)用磁珠可成功地將MM-AN細(xì)胞的MOI從16降到4）。購(gòu)置或構(gòu)建克隆時(shí)，可選擇載體骨架上帶有標(biāo)記基因（如：PuromycinNeomycin等）的克隆，可方便后續(xù)進(jìn)行藥品篩選，建立將目的基因成功地隨機(jī)整合到特定細(xì)胞的穩(wěn)定細(xì)胞株。二、慢病毒感染目的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)1.感染預(yù)實(shí)驗(yàn)以24孔培養(yǎng)板為例，同時(shí)進(jìn)行目的細(xì)胞和工具細(xì)胞的感染預(yù)實(shí)驗(yàn)。工具細(xì)胞可選擇293T（人胚腎上皮細(xì)胞）、H1299（人肺癌細(xì)胞）或其它細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)材料：培養(yǎng)基、24孔培養(yǎng)板，移液槍，槍頭，EP管，細(xì)胞計(jì)數(shù)板、冰盒、廢液缸等。（根據(jù)目的細(xì)胞狀況，可酌情使用Polybrene）Day1：準(zhǔn)備細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)久，細(xì)胞以胰酶消化計(jì)數(shù)后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)出細(xì)胞密度，每孔接種5×104個(gè)細(xì)胞，添加細(xì)胞培養(yǎng)液至500μL。普通狀況下，該接種量的H1299或293T細(xì)胞在感染后第3天可生長(zhǎng)至80%-90%融合度。（接種目的細(xì)胞時(shí)，請(qǐng)根據(jù)細(xì)胞的實(shí)際生長(zhǎng)速度調(diào)節(jié)接種量，使目的細(xì)胞感染后第3天生長(zhǎng)至80%-90%融合度）Day2：（1）準(zhǔn)備慢病毒顆粒：計(jì)算所需慢病毒顆粒的量，將凍存在-80℃的慢病毒顆粒取出，冰浴融化；（2）感染目的細(xì)胞：從培養(yǎng)箱中拿出細(xì)胞，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及細(xì)胞融合度；如細(xì)胞狀態(tài)較好，則開始實(shí)驗(yàn)：A.用移液槍小心吸去24孔板中的舊培養(yǎng)液，加入新的完全培養(yǎng)液；B.在細(xì)胞中分別加入計(jì)算好的慢病毒顆粒液，將培養(yǎng)板平置于工作臺(tái)上，以劃8字的方式輕柔混勻；C.混勻后，細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)。Day3：更換培養(yǎng)液：感染12-16小時(shí)后，吸出含慢病毒顆粒的培養(yǎng)液，重新向培養(yǎng)板添加含5%滅活FBS（胎牛血清）的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。（目的細(xì)胞需要調(diào)節(jié)感染時(shí)長(zhǎng)，部分細(xì)胞不可感染超出12小時(shí)。）Day4：繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，觀察細(xì)胞狀態(tài)與否有異常。Day5：觀察（評(píng)定）慢病毒顆粒感染效率：蓋緊24孔培養(yǎng)板，使用70%乙醇清理培養(yǎng)板外壁，在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，拍照并預(yù)計(jì)慢病毒顆粒對(duì)細(xì)胞的感染效率。（如果慢病毒顆粒攜帶的基因體現(xiàn)所需的時(shí)間較長(zhǎng)，熒光體現(xiàn)所需時(shí)間也較長(zhǎng)，建議感染72、96小時(shí)后觀察熒光體現(xiàn)。）根據(jù)熒光狀況，能夠初步從MOI梯度探索實(shí)驗(yàn)中，找出最適合目的細(xì)胞的MOI值。圖1.H1299細(xì)胞的MOI梯度探索成果示例示例中使用的慢病毒顆粒是LPP-eGFP-Lv105（滴度1×108TU/mL），曝光時(shí)間1s，顯微倍數(shù)100×。從上圖可見第2組細(xì)胞的感染效率已達(dá)成90%。由于慢病毒顆粒對(duì)細(xì)胞有一定毒性，當(dāng)MOI值過高時(shí)，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細(xì)胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。熒光報(bào)告基因和目的基因的相對(duì)體現(xiàn)并不總是成等比關(guān)系的。在有的狀況下，即使熒光報(bào)告基因體現(xiàn)較低或無體現(xiàn)，目的基因仍然能夠體現(xiàn)；反之亦然。因此在觀察熒光效果后，建議使用qRT-PCR作進(jìn)一步鑒定。圖2.293T細(xì)胞的MOI梯度探索成果示例示例中使用的慢病毒顆粒是LPP-eGFP-Lv105（滴度1×108TU/mL），曝光時(shí)間0.6s，顯微倍數(shù)100×。從上圖可見第2組細(xì)胞的感染效率已達(dá)成80%。由于慢病毒顆粒對(duì)細(xì)胞有一定毒性，當(dāng)MOI值過高時(shí)，繼續(xù)添加慢病毒顆粒，感染效率沒有明顯增加，且細(xì)胞狀態(tài)容易變差、皺縮甚至死亡。2.探索細(xì)胞的最適藥品篩選濃度細(xì)胞的種類與狀態(tài)均會(huì)影響慢病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，部分細(xì)胞可能與慢病毒顆粒有互相抵抗的現(xiàn)象，造成感染效率低。當(dāng)您在感染后72、96小時(shí)后發(fā)現(xiàn)感染效果仍不抱負(fù)，建議對(duì)感染后的細(xì)胞進(jìn)行藥品篩選（藥篩），以收集較多感染成功的細(xì)胞。慢病毒顆粒攜帶的基因整合到目的細(xì)胞基因組是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，當(dāng)抗性基因體現(xiàn)時(shí)，目的基因不一定也能體現(xiàn)，在進(jìn)行藥篩解決后，還要以qRT-PCR作進(jìn)一步鑒定。在進(jìn)行正式的抗生素篩選前，建議您先對(duì)空白細(xì)胞的最小致死濃度進(jìn)行探索、優(yōu)化。表4.抗生素篩選細(xì)胞的有關(guān)參考值以293T細(xì)胞+Puromycin為例，從有關(guān)文獻(xiàn)查得Puromycin對(duì)293T細(xì)胞的最小致死濃度為2μg/mL。在2μg/mL附件多設(shè)立幾個(gè)濃度梯度，能夠得出較精確的的篩選濃度。（1）準(zhǔn)備24孔培養(yǎng)板，按每孔1-5×104細(xì)胞數(shù)(約等于20%-35%融合度)接種293T空白細(xì)胞，對(duì)其中6個(gè)孔進(jìn)行鋪板；（2）普通Puromycin母液的濃度是10mg/mL，用細(xì)胞培養(yǎng)基將Puromycin母液稀釋1000倍，可獲得終濃度為10μg/mL的Puromycin稀釋液；（3）按表5所示，每孔添加對(duì)應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基和Puromycin；（4）24孔培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過夜；（5）按表4的藥篩時(shí)間和觀察時(shí)間建議，定時(shí)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。當(dāng)空白細(xì)胞剛好能全部死亡時(shí)，該濃度的抗生素可作為最適藥篩濃度。表5.藥品篩選濃度梯度參考（Puromycin）*表格中使用的Puromycin濃度為10μg/mL，是由10mg/mL的Puromycin母液以細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋1000倍所得。注：以上表格的設(shè)立僅供參考。普通即使細(xì)胞同樣，由于培養(yǎng)的條件和傳代次數(shù)不同，篩選濃度亦不同。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)成果進(jìn)行更進(jìn)一步的細(xì)化濃度梯度設(shè)立。如果藥篩過程中細(xì)胞量較少，為保持細(xì)胞的數(shù)一定，普通不換液，只有在穩(wěn)轉(zhuǎn)株藥篩過程中，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度，3-4天換液一次。如果目的細(xì)胞較難感染，一次感染不能達(dá)成預(yù)期效果時(shí)，在感染3天后可對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行藥篩解決，獲得較多被感染的細(xì)胞，以下列例子所示：圖3.人食管癌細(xì)胞CE-81T（貼壁細(xì)胞）的藥篩前后效果對(duì)比圖4.人骨肉瘤細(xì)胞Hos（貼壁細(xì)胞）的藥篩前后效果對(duì)比圖5.人白血病K562（懸浮細(xì)胞）的藥篩前后效果對(duì)比附：細(xì)胞融合度參考圖6.293T細(xì)胞在不同融合度的明視野效果（放大倍數(shù)：100×）3.實(shí)驗(yàn)體系的放大和正式實(shí)驗(yàn)；根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)成果，放大慢病毒顆粒細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)，實(shí)施正式實(shí)驗(yàn)。通過慢病毒顆粒感染細(xì)胞的預(yù)實(shí)驗(yàn)，我們大致獲得慢病毒顆粒感染目的細(xì)胞的優(yōu)化條件。正式實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞數(shù)往往比預(yù)實(shí)驗(yàn)多，慢病毒顆粒用量也需要適宜放大。放大原則是保持細(xì)胞密度一致，按實(shí)際細(xì)胞數(shù)與預(yù)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)的比例放大培養(yǎng)液體積和慢病毒顆粒用量。有兩種放大辦法可供參考：按底面積放大（合用于貼壁細(xì)胞）當(dāng)細(xì)胞的密度不變時(shí)，細(xì)胞總數(shù)和底面積成正比，且MOI不變，所需慢病毒顆粒用量也和底面積成正比。假設(shè)預(yù)實(shí)驗(yàn)使用96孔板（底面積0.3cm2），使用1μL慢病毒顆粒（滴度1×108TU/mL）可成功感染細(xì)胞；如正式實(shí)驗(yàn)使用6孔板（底面積10cm2），則：底面積的放大倍數(shù)≈33正式的慢病毒顆粒用量=預(yù)實(shí)驗(yàn)用量×33=33μL慢病毒顆粒（滴度1×108TU/mL）注：請(qǐng)確保細(xì)胞均勻、單層分布，不成簇生長(zhǎng)。按培養(yǎng)體積放大（合用于懸浮細(xì)胞）當(dāng)細(xì)胞的密度不變時(shí)，細(xì)胞總數(shù)和感染體積成正比，且MOI不變，所需慢病毒顆粒用量也和培養(yǎng)液體積成正比。假設(shè)預(yù)實(shí)驗(yàn)使用96孔板（培養(yǎng)體積100μL），使用1μL慢病毒（滴度1×108TU/mL）可成功感染細(xì)胞；如正式實(shí)驗(yàn)使用6孔板（培養(yǎng)體積2mL），則：培養(yǎng)體積的放大倍數(shù)=20正式的慢病毒顆粒用量=預(yù)實(shí)驗(yàn)用量×20=20μL慢病毒顆粒（滴度1×108TU/mL）注：請(qǐng)確保細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。三、使用慢病毒的常見問題1.如何購(gòu)置份量適宜數(shù)量的慢病毒顆粒？一套完整實(shí)驗(yàn)所需的慢病毒顆粒涉及：1.含有目的基因的慢病毒顆粒，2.陰性對(duì)照慢病毒顆粒，3.用于預(yù)實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照慢病毒顆粒。購(gòu)置時(shí)能夠根據(jù)目的細(xì)胞特性、檢測(cè)辦法、培養(yǎng)器皿估算慢病毒顆粒的最佳用量，避免剩余的大量慢病毒顆粒超出最佳保存期；另外，GeneCopoeiaTM同時(shí)提供高滴度低價(jià)格的陽(yáng)性對(duì)照慢病毒顆粒，協(xié)助您以較低的預(yù)算和較充足的材料完畢預(yù)實(shí)驗(yàn)的條件探索。初次使用慢病毒顆粒的研究者也可使用陽(yáng)性對(duì)照慢病毒顆粒熟悉實(shí)驗(yàn)過程。2.慢病毒顆粒能夠用于動(dòng)物體內(nèi)（Invivo）實(shí)驗(yàn)嗎？GeneCopoeiaTM提供的即用型慢病毒顆粒全部通過純化、濃縮解決，去除了細(xì)胞碎片等雜質(zhì)，進(jìn)一步減少免疫原性，合用于各類活體動(dòng)物注射實(shí)驗(yàn)和成瘤實(shí)驗(yàn)。3.慢病毒顆粒對(duì)目的細(xì)胞的感染效率很低，如何提高感染效率？提高感染效率的前提是確保細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。另首先，能夠通過提高M(jìn)OI值來提高感染效率，也能夠在培養(yǎng)基中加入Polybrene(4-10μg/mL)提高感染效率。4.添加慢病毒顆粒后，細(xì)胞為什么大量死亡?慢病毒顆粒對(duì)靶細(xì)胞有一定毒性。添加量過多、感染時(shí)間過長(zhǎng)都可能對(duì)目的細(xì)胞造成傷害。如遇上這種狀況，建議您減少M(fèi)OI值，并在感染細(xì)胞4-8小時(shí)后進(jìn)行換液（以新鮮的全培養(yǎng)基替代含慢病毒顆粒的舊培養(yǎng)基），最長(zhǎng)換液時(shí)間不可不不大于12小時(shí)。5.Polybrene是什么？在慢病毒顆粒感染中，Polybrene添加越多越好嗎？Polybrene是慣用的感染添加劑，普通的使用濃度為4-10μg/mL，Polybrene能明顯提高慢病毒的感染效率，普通能提高感染效率2-10倍，對(duì)部分細(xì)胞甚至可提高感染效率10-20倍。當(dāng)目的細(xì)胞MOI高于20時(shí)，我們建議在培養(yǎng)基中加入Ploybrene(約4-10μg/mL)適宜提高感染效率。然而，Polybrene有一定的細(xì)胞毒性，不同細(xì)胞對(duì)Polybrene的敏感度和耐受性不同，部分細(xì)胞對(duì)Polybrene反映明顯，容易造成細(xì)胞狀態(tài)變差、形態(tài)發(fā)生變化、甚至死亡，因此并非每種細(xì)胞都適合添加Polybrene。在正