野生與近交系中有鯽遺傳多樣性分析

野生與近交系中有鯽遺傳多樣性分析

隨著科學(xué)研究水平的提高，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的級(jí)別和質(zhì)量要求更加嚴(yán)格。為合格的高水平和優(yōu)質(zhì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物提供高質(zhì)量的樣品是科學(xué)研究活動(dòng)的極為重要的任務(wù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物近交系因具有遺傳上的基因純合性、表型一致性等特點(diǎn),能夠提高許多實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性,因此廣泛地應(yīng)用于各領(lǐng)域的研究中。近交系鑒定及遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)的方法包括形態(tài)學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞遺傳標(biāo)記檢測(cè)、生化標(biāo)記檢測(cè)、免疫標(biāo)記檢測(cè)、分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)等,各種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和局限。我國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物-哺乳類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制》規(guī)定生化標(biāo)記檢測(cè)和皮膚移植法為必檢項(xiàng)目。對(duì)于魚(yú)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,目前尚沒(méi)有統(tǒng)一的方法及標(biāo)準(zhǔn)。稀有鯽(Gobiocyprisrarus)是我國(guó)特有的小型鯉科魚(yú)類(lèi),它具有許多作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn),有望成為我國(guó)乃至世界通用的一種魚(yú)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。目前,本實(shí)驗(yàn)室采用兄妹交配的方式培育的近交系已至23代。參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物-哺乳類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制》中近交系的命名法則,作者將該近交系命名為HAN系。HAN取名于“漢”的拼音,包括三層含義:一是該品系的原種采自稀有鯽的模式產(chǎn)地四川省漢源縣,取漢源之“漢”音;二是該品系是中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所在武漢培育的,取武漢之“漢”音;三是稀有鯽是我國(guó)特有的物種,是我國(guó)自主開(kāi)發(fā)的魚(yú)類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,取中文漢字之“漢”音。為了獲取近交系的遺傳背景資料庫(kù),檢測(cè)近交系的遺傳純合度,建立稀有鯽品系鑒定的方法,作者從魚(yú)體外部形態(tài)、骨骼形態(tài)、免疫學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記、分子遺傳標(biāo)記等層次對(duì)HAN系的遺傳質(zhì)量進(jìn)行了檢測(cè),本文報(bào)道了利用微衛(wèi)星技術(shù)進(jìn)行分子遺傳標(biāo)記檢測(cè)的研究結(jié)果。1材料和方法1.1“漢源縣”的采源實(shí)驗(yàn)所用稀有鯽共80尾。其中,野生個(gè)體于2006年1月采于四川省漢源縣,30尾;近交HAN系為實(shí)驗(yàn)室培育近交至第20代個(gè)體(F20)20尾,第22代個(gè)體(F22)30尾。1.2方法1.2.1平衡酚-可基性酚抽提背部肌肉組織中DNA的提取方法參照標(biāo)準(zhǔn)平衡酚-氯仿抽提程序進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量和濃度,置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2pcr反應(yīng)總體積及程序選用19對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中4對(duì)為本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的稀有鯽特異性引物(GR08-GR25),15對(duì)由廖小林等設(shè)計(jì)(Gra01-Gra30)。引物序列及其PCR擴(kuò)增條件(表1)。PCR反應(yīng)總體積為10μL,其中10×PCRbuffer1μL,dNTP(2.5mmol/L)0.8μL,上游引物(5pmol/μL)1μL,下游引物(5pmol/μL)1μL,Taq酶(2U/μL)0.25μL,DNA模板(0.2mg/μL)0.1μL,滅菌雙蒸水4.95μL。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min,94℃變性30s,退火40s,72℃延伸40s,35個(gè)循環(huán),72℃充分延伸10min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,然后GeneGenius凝膠成像系統(tǒng)掃描、拍照。1.2.3種群間的遺傳距離和基因組織的計(jì)算根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠上DNA泳動(dòng)距離進(jìn)行結(jié)果判讀,泳動(dòng)距離最長(zhǎng)的帶設(shè)為“1”,依此類(lèi)推。DNA泳動(dòng)距離一致的,即表現(xiàn)為單態(tài)性,若有差異即為多態(tài)性。參考分子量大小,統(tǒng)計(jì)每個(gè)個(gè)體在所研究基因位點(diǎn)上表現(xiàn)出的多態(tài)性條帶數(shù)目,確定等位基因數(shù)目。統(tǒng)計(jì)各群體的等位基因組成,利用POPGENE3.0軟件計(jì)算各微衛(wèi)星位點(diǎn)在群體中的基因頻率分布情況,計(jì)算基因純合率、各群體的平均雜合度和平均多態(tài)信息含量和各群體間的遺傳距離。根據(jù)遺傳距離,運(yùn)用TFPGA軟件采用非加權(quán)組平均法(UnweightedPairGroupmethodusingarithmeticAverage,UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析。2結(jié)果2.1微衛(wèi)星位點(diǎn)基因數(shù)和基因頻率本研究選用了19對(duì)引物對(duì)野生和近交稀有鯽進(jìn)行了遺傳變異分析。其中,引物Gra17、Gra21的擴(kuò)增效果較差,剩余的17對(duì)引物具有穩(wěn)定的擴(kuò)增效果,均能穩(wěn)定重復(fù)地?cái)U(kuò)增出相應(yīng)的PCR產(chǎn)物。部分?jǐn)U增圖譜(圖1)。稀有鯽17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)和基因頻率(表2)。17對(duì)微衛(wèi)星引物在野生群體中共檢測(cè)到64個(gè)等位基因,在HAN系F20、F22中檢測(cè)到的等位基因數(shù)各為26、21。在野生群體中每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)從2個(gè)到6個(gè)不等,而在HAN系F20、F22中等位基因數(shù)為1—2個(gè)。其中,11對(duì)引物在HAN系F20中探測(cè)到的等位基因數(shù)均為1,而在HAN系F22中則發(fā)現(xiàn)有13對(duì)引物在其所有個(gè)體中只擴(kuò)增出一條DNA帶。GR09、Gra03、Gra08、Gra15、Gra19、Gra25、Gra27、Gra30的擴(kuò)增圖譜在HAN系F20、F22之間無(wú)差異,呈現(xiàn)了高度的一致性,且所有的個(gè)體都只擴(kuò)增出一條帶,基因呈現(xiàn)純合。2.2遺傳多樣性分析根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因分型結(jié)果,稀有鯽不同群體的平均基因純合率(表3)。17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均基因純合率分別為野生群體46.84%、HAN系F2086.18%、HAN系F2291.96%。HAN系F20、F22的基因純合率明顯高于野生群體的,說(shuō)明稀有鯽經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的近交已達(dá)到了很高的近交程度,近交對(duì)基因的純化具有明顯的效果。遺傳雜合度能夠反映群體在各位點(diǎn)的遺傳變異情況,是度量群體遺傳變異的一個(gè)理想?yún)?shù)。從表3中可以看出,野生群體的平均雜合度為0.5744,明顯高于HAN系F20、F22,說(shuō)明其遺傳多樣性較豐富。在所研究的17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中,野生群體、HAN系F20、近交F22的平均多態(tài)信息含量分別為0.5252、0.3838、0.3837。野生種群的平均多態(tài)信息含量最高,說(shuō)明野生種群存在較大的變異度,具有豐富的遺傳多態(tài)性。2.3間遺傳相似性指數(shù)和間遺傳距離依據(jù)17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR擴(kuò)增結(jié)果,計(jì)算出群體間的遺傳相似性指數(shù)和遺傳距離(表4)。從表可見(jiàn),群體間遺傳相似性指數(shù)最大的為HAN系F20和F22的0.8104,其遺傳距離最小為0.2102,說(shuō)明二者的親緣關(guān)系最近;野生群體和HAN系F22的遺傳距離最大,遺傳相似性指數(shù)最小,說(shuō)明二者的遺傳變異程度是群體中最大的,親緣關(guān)系較遠(yuǎn);而野生群體和HAN系F20的遺傳距離和遺傳相似性指數(shù)介于上述二者之間。2.4聚類(lèi)分析根據(jù)遺傳距離,用UPGMA法對(duì)稀有鯽進(jìn)行了聚類(lèi)分析(圖2)。3個(gè)群體明顯的分為近交和野生兩種類(lèi)型。3討論3.1微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性近交使基因趨于純合,平均基因純合率在很大程度上代表一個(gè)群體的近交程度。稀有鯽HAN系F20、F22的平均基因純合率都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于野生種群,這與近交系的近交程度均較高有關(guān)。由于長(zhǎng)期的近交,某些基因不斷地被淘汰,基因型也漸趨于純合;并且在長(zhǎng)期的室內(nèi)培育過(guò)程中,由于沒(méi)有外來(lái)血緣的加入,從而也導(dǎo)致了遺傳基因多樣性的低水平。Botstein,etal.首先提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo):當(dāng)PIC>0.5時(shí),該位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn);0.25<PIC<0.5時(shí),該位點(diǎn)為中度多態(tài)位點(diǎn);當(dāng)PIC<0.25時(shí),該位點(diǎn)為低度多態(tài)位點(diǎn)。本研究中HAN系F20和F22在17個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均PIC均低于0.5,明顯低于野生群體(高度多態(tài)),屬于中度多態(tài),表明可能由于長(zhǎng)期的近交使部分等位基因已丟失,因而基因位點(diǎn)多態(tài)性降低,多態(tài)信息含量明顯降低。在本研究中,野生群體平均雜合度為0.5744,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于HAN系F20、F22,其遺傳多樣性較高。這與王劍偉等利用RAPD技術(shù)進(jìn)行稀有鯽野生和近交群體的遺傳多樣性分析的研究中所取得的結(jié)果是一致的。綜上所述,稀有鯽經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的近交已經(jīng)達(dá)到較高的近交程度,與野生種群相比遺傳多樣性明顯降低,較低的平均雜合度和平均多態(tài)信息含量以及較高的平均基因純合率,都表明近交系內(nèi)大多數(shù)為純合位點(diǎn),近交對(duì)稀有鯽的遺傳純化已產(chǎn)生了明顯的作用。類(lèi)似的結(jié)果在很多研究中都有報(bào)道。利用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)20代兄妹連續(xù)交配的SLA豬進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),大量高度多態(tài)性位點(diǎn)的基因多樣性降低,而個(gè)體間的相似性卻很高;對(duì)23個(gè)近交系雞MHC基因的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)42個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的條帶共享率為0.74—0.96,說(shuō)明群體的一致性很高。對(duì)連續(xù)近交6代豬的微衛(wèi)星基因雜合度進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因雜合度由0世代的0.616下降到5世代的0.284。需要說(shuō)明的是HAN系F22中還有一小部分微衛(wèi)星位點(diǎn)未純合,表現(xiàn)出一定的多態(tài)性。鄭康等對(duì)草魚(yú)連續(xù)兩代雌核發(fā)育群體基因組DNA進(jìn)行微衛(wèi)星比較分析發(fā)現(xiàn),一代人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育草魚(yú)群體中個(gè)體之間的基因型還不完全一致,表現(xiàn)出一定的多態(tài)性,連續(xù)兩代誘導(dǎo)后不僅所檢測(cè)個(gè)體的基因位點(diǎn)已完全純合,并且各個(gè)體的基因型也完全一致。因此,今后還需要對(duì)稀有鯽繼續(xù)進(jìn)行近交培育和繁殖,并定時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。3.2近交圖譜分析從各群體的等位基因組成可以評(píng)價(jià)其遺傳背景。17對(duì)引物在野生個(gè)體中共檢測(cè)到65個(gè)等位基因,在HAN系中只檢測(cè)到26個(gè),表明近交過(guò)程中已有大量等位基因丟失。其中,有18個(gè)等位基因?yàn)槿咚灿?這些等位基因可能在整個(gè)基因組中比較保守。HAN系中有較多的單態(tài)位點(diǎn),其中F20有11個(gè),F22有13個(gè),而它們共有的單態(tài)位點(diǎn)有8個(gè)。近交譜系分析發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)所采用的F20和F22并非完全同支,它們的前18代是相同的,但從第19代起屬于不同的分支,因此基因純合的速率(與親本基因型是否純合有關(guān))以及純合的基因位點(diǎn)都會(huì)有差異,但是隨著近交世代的增加,雜合基因型將進(jìn)一步淘汰,基因純合程度越來(lái)越高。此外,在微衛(wèi)星位點(diǎn)GR08中,HAN系F20、F22在147—164bp之間有一個(gè)等位基因,但在野生個(gè)體中沒(méi)有。近期研究表明,在對(duì)1997年、2006年采自漢源的各30尾標(biāo)本的檢測(cè)中也未發(fā)現(xiàn)該等位基因(內(nèi)部資料),因此推測(cè)近交過(guò)程中發(fā)生了基因突變。如果該等位基因在今后的近交培育中得以保留并純合,可以作為HAN系的一個(gè)鑒別標(biāo)記。3.3微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳檢測(cè)近交系動(dòng)物是基因高度純合的動(dòng)物群體,其等位基因純合度理論上可達(dá)到99.8%,基因純合性和同基因性是近交系的顯著特點(diǎn)。以微衛(wèi)星的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后用聚丙烯酰胺凝膠分離PCR產(chǎn)物,可以從分子水平上直接反映近交系的基因純合度及同基因性。生化標(biāo)記檢測(cè)是近交系遺傳質(zhì)量控制中最為常用的方法,這一方法是檢測(cè)同工酶或異構(gòu)蛋白的變化來(lái)推測(cè)的基因變化。由于同工酶基因位點(diǎn)是編碼區(qū),受環(huán)境的選擇壓力較大,不易發(fā)生變異,可以檢測(cè)的多態(tài)位點(diǎn)較少,在很大程度上低估了整個(gè)基因組的遺傳變異水平。Asahida,etal.利用PCR-RFLP和Fujio,etal.利用同工酶標(biāo)記都沒(méi)有檢測(cè)到牙鲆自然群體間的遺傳差異,而Sekino,etal.利用11個(gè)微衛(wèi)星引物成功的檢測(cè)到不同地理種群間的遺傳差異。因而,生化標(biāo)記與直接從DNA分子水平進(jìn)行檢測(cè)的微衛(wèi)星標(biāo)記相比,明顯存在著許多弊端,如準(zhǔn)確度、靈敏度低,反映的遺傳概貌有限等。利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)近交系動(dòng)物的檢測(cè)不僅簡(jiǎn)便、快捷,而且微衛(wèi)星標(biāo)記具有高度的多態(tài)性和豐富的可供個(gè)體識(shí)別標(biāo)志的微衛(wèi)星位點(diǎn),能夠比較全面的反映基因組的遺傳及變異情況,近年來(lái)已在水生動(dòng)物家系鑒定、哺乳類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)