口腔黏膜病變過程中中心體的變化

口腔黏膜病變過程中中心體的變化

口腔鱗狀細(xì)胞癌（osc）是口腔的主要腫瘤，通常來自于組織上因表皮異常增生而導(dǎo)致的腫瘤前損傷。與一般身體其他部位的腫瘤相比，它具有較高的死亡率和致殘率。其中,缺少有效的分子標(biāo)志來預(yù)測癌前病損的發(fā)展是其預(yù)后較差的原因之一。基因不穩(wěn)定目前認(rèn)為是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),非整倍體作為染色體不穩(wěn)定(chromosomeinstability,CIN)特征性表現(xiàn)形式出現(xiàn)在包括頭頸部腫瘤在內(nèi)的許多類型腫瘤的發(fā)展早期,中心體異常導(dǎo)致的有絲分裂紡錘體缺陷是非整倍體形成的重要原因。中心體的擴(kuò)增可見于多種人類腫瘤,提示其可能是多種腫瘤發(fā)生過程中共同的促進(jìn)因素。但已有的研究大多局限在對腫瘤細(xì)胞株的觀察,對腫瘤組織中,尤其OSCC及癌前病損組織中中心體的狀況尚未見報(bào)道,中心體異常在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用仍然不清楚。本研究的目的是了解口腔黏膜癌變過程中中心體的狀況,探討中心體的異常在OSCC發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。1材料和方法1.1口腔黏膜癌前損害個體質(zhì)量表1研究標(biāo)本來自于英國布尼斯托大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院。選擇病理資料完整且未經(jīng)任何治療的手術(shù)切除或活檢組織,經(jīng)10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、常規(guī)蘇木精-伊紅染色及嚴(yán)格的病理診斷,選取正?？谇火つ?2例,上皮異常增生22例,口腔鱗狀細(xì)胞癌32例。按1997年WHO關(guān)于口腔黏膜癌前損害及口腔腫瘤的診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類,其中:輕度上皮異常增生2例,中度上皮異常增生8例,重度上皮異常增生12例;高分化鱗癌10例,中分化鱗癌15例,低分化鱗癌7例。所有腫瘤標(biāo)本均為腫瘤原發(fā)病損,且未經(jīng)過放化療。每例標(biāo)本作4μm連續(xù)切片2張,裱于防脫片劑處理的載玻片上,37℃烤箱中烘烤過夜。1張常規(guī)蘇木精-伊紅染色由兩位病理醫(yī)生盲法重新作組織病理學(xué)診斷核實(shí),另1張作間接免疫熒光染色(immunofluorescence,IF)顯示組織中的中心體。1.2檢測中心1.2.1試驗(yàn)兔抗人細(xì)胞角蛋白多克隆抗體1809一抗:鼠抗人γ_微管蛋白單克隆抗體(GTU_88,T6557)(Sigma公司,美國),兔抗人細(xì)胞角蛋白多克隆抗體(18_0059)(Zymed公司,美國);二抗:細(xì)胞色素III標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma公司,英國),FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(F0382)(Sigma公司,美國)。1.2.2細(xì)胞熒光標(biāo)記daps觀察采用間接免疫熒光染色顯示組織細(xì)胞的中心體。石蠟組織塊切片4μm厚,貼片于經(jīng)過防脫片劑處理的玻片上,經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后,將切片浸沒于1L的枸櫞酸鹽緩沖液(0.1mol/L,pH6.0)并置于960W的微波爐中高火加熱30min,然后將切片在緩慢流水的注入中冷卻至室溫,并用PBS(pH7.2)洗2次。滴加一抗混和液,即將γ_微管蛋白單抗(濃度1∶200)及細(xì)胞角蛋白多抗(濃度1∶70)分別稀釋于封閉用的正常羊血清(10%正常羊血清稀釋于PBS),其中的γ_微管蛋白單抗用于顯示細(xì)胞的中心體,而細(xì)胞角蛋白多抗用于定位組織中上皮細(xì)胞;室溫下于濕盒內(nèi)孵育1h后,PBS洗3次;然后滴加二抗混和液,即將細(xì)胞色素III標(biāo)記的羊抗鼠IgG(濃度1∶250)和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(濃度1∶80)分別稀釋于PBS,在室溫下于避光濕盒內(nèi)孵育1h,用PBS及雙蒸水各洗1次,自然干燥后,用細(xì)胞核特異性染料DAPI襯染顯示細(xì)胞核,封片。以同一張切片內(nèi)非腫瘤對照細(xì)胞的中心體為參照,觀察染色(中心體顯示)是否成功以及腫瘤及上皮細(xì)胞內(nèi)中心體大小、數(shù)目及形態(tài)的改變。每批染色同時(shí)從研究標(biāo)本中隨機(jī)抽取2~4張切片,以一抗中不加γ_微管蛋白的同步染色作為陰性對照。1.3結(jié)果觀察1.3.1光點(diǎn)大小及其細(xì)胞的熒光正常中心體表現(xiàn)為形狀大小均勻一致的紅色熒光小點(diǎn),在正常間期細(xì)胞通常為1個,為靠近核膜的熒光小圓點(diǎn);而在有絲分裂期細(xì)胞,可以觀察到2個中心體,分別位于紡錘體的兩極。1.3.2中心體的觀察和觀察具有以下特征之一的中心體即判斷為異常中心體:①中心體的直徑大于同一張切片非腫瘤對照細(xì)胞中心體直徑的2倍及以上;非腫瘤對照細(xì)胞包括結(jié)締組織中的纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及成熟的非瘤性上皮細(xì)胞;②一個細(xì)胞內(nèi)觀察到3個或3個以上中心體;③形狀異常中心體,包括直徑大于3μm的長形中心體、線狀中心體、成塊狀中心體及成簇堆積中心體。1.3.3異常中心細(xì)胞計(jì)數(shù)中心體在熒光顯微鏡下為位于胞核或胞核旁的圓形紅色熒光顆粒,細(xì)胞角蛋白為位于細(xì)胞質(zhì)的綠色熒光,細(xì)胞核為藍(lán)色熒光。計(jì)數(shù)方法:在熒光顯微鏡10×100放大倍數(shù)下,每張染色片上選取腫瘤區(qū)或上皮區(qū)具有代表性的視野5~10個,分別計(jì)數(shù)視野內(nèi)腫瘤或上皮細(xì)胞數(shù)及其中具有異常中心體的細(xì)胞數(shù),并計(jì)算出每個樣本異常中心體細(xì)胞占所計(jì)數(shù)的腫瘤或上皮細(xì)胞數(shù)的百分率。未能及時(shí)觀察的切片置于4℃冰箱內(nèi)避光保存。1.4中心體異常程度評價(jià)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。相關(guān)分析采用spearman等級相關(guān)檢驗(yàn),中心體異常程度(以每個樣本中異常中心體細(xì)胞占所計(jì)數(shù)細(xì)胞的百分率為指標(biāo))在兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析,在多組間的比較采用方差分析,組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1熒光點(diǎn)細(xì)胞tki12例正?？谇火つど掀ぞ鶠檎Ｖ行捏w,表現(xiàn)為1~2個位于細(xì)胞核或核膜附近均勻的圓形紅色熒光小點(diǎn),其中絕大部分的中心體見于上皮下1/2層的細(xì)胞(圖1)。2.2中心體數(shù)目的增多22例上皮異常增生組織中,16例(72.73%)觀察到部分上皮細(xì)胞中出現(xiàn)異常中心體(均為中度到重度異常增生上皮),表現(xiàn)為中心體直徑的增加及數(shù)目的增多(圖2)。其中,中心體數(shù)目的增多是最常見的表現(xiàn)形式;中心體異常細(xì)胞百分率在輕、中、重度異常增生分別為0,(2.81±0.52)%,(3.89±0.87)%,但此差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.3中心體數(shù)目的增增性32例OSCC中,27例(84.38%)OSCC觀察到部分腫瘤上皮細(xì)胞中出現(xiàn)異常中心體,表現(xiàn)為中心體直徑的增加、數(shù)目的增多或形狀異常(圖3),其中,以中心體數(shù)目的增多最為常見。中心體異常細(xì)胞百分率在高、中、低分化鱗癌分別為(4.83±1.60)%、(5.83±1.58)%、(5.78±1.76)%,不同分化各組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.4等級相關(guān)分析中心體異常細(xì)胞百分率隨上皮異常增生程度的增加及腫瘤分化程度的降低而增加(圖4),經(jīng)等級相關(guān)分析,二者存在明顯的正相關(guān)關(guān)系(spearman相關(guān)系數(shù)r=0.955,P<0.01)。OSCC組中心體異常細(xì)胞百分率(5.52±1.62)%,高于上皮異常增生組(3.49±0.91)%,兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.26,P<0.01)。3中心體異常程度對oscc發(fā)育的機(jī)制分析目前認(rèn)為基因不穩(wěn)定是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié),CIN是口腔癌中最常見的基因不穩(wěn)定形式,其中,以細(xì)胞染色體數(shù)目不成倍數(shù)的增加或減少為表現(xiàn)的非整倍體是CIN最常見的表現(xiàn)形式。已有報(bào)道:90%以上的OSCC存在一條或多條染色體數(shù)目的異常,染色體的異倍體也見于相當(dāng)比例的口腔癌旁正常組織及癌前病損,并與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程有關(guān),非整倍體作為高風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志已經(jīng)被用于預(yù)測口腔癌前病損的癌變進(jìn)程指標(biāo)之一。非整倍體發(fā)生的機(jī)制一個可能的原因是細(xì)胞分裂過程中多極紡錘體的形成而導(dǎo)致染色體分離錯誤。中心體作為主要的微管組織中心在有絲分裂期細(xì)胞紡錘體的形成中起著重要作用。中心體的擴(kuò)增和染色體不穩(wěn)定都只見于非整倍體腫瘤及其來源的細(xì)胞株中,提示中心體的擴(kuò)增與非整倍體的發(fā)生可能存在直接機(jī)制上的聯(lián)系。γ_微管蛋白作為中心體微管蛋白家族的一個特殊成員,對γ_微管蛋白的免疫熒光染色是顯示細(xì)胞內(nèi)中心體的可靠方法。本研究的結(jié)果顯示,有相當(dāng)比例的上皮異常增生及口腔鱗狀細(xì)胞癌病損都有中心體異常擴(kuò)增,但具有異常中心體的細(xì)胞所占的百分比較低,提示中心體擴(kuò)增是口腔癌前病損及口腔鱗狀細(xì)胞癌中普遍存在的細(xì)胞學(xué)異?，F(xiàn)象;病損中中心體異常細(xì)胞百分比較低,提示上皮異常增生及口腔鱗狀細(xì)胞癌病損的細(xì)胞之間存在克隆異質(zhì)性。上皮異常增生是口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生過程中組織學(xué)上可見的最早改變,具有一些與鱗狀細(xì)胞癌共同的基因或形態(tài)學(xué)改變的特征。本研究結(jié)果顯示中心體的擴(kuò)增可以出現(xiàn)在腫瘤發(fā)生過程中形態(tài)學(xué)變化的最早期階段,提示中心體的擴(kuò)增是口腔黏膜癌變過程中的早期事件;中心體異常程度隨著上皮異常增生程度的增加及腫瘤分化程度的降低而增加,且癌變組織(OSCC)中心體異常程度高于癌前組織,表明口腔黏膜癌變過程中存在異常中心體細(xì)胞數(shù)量上的逐漸累積,這一結(jié)果支持頭頸部多步致癌學(xué)說,提示中心體的缺陷不僅可能在OSCC發(fā)生早期有作用,而且可能與口腔癌發(fā)展進(jìn)程有關(guān)。細(xì)胞核不典型、細(xì)胞排列紊亂以及細(xì)胞失去極性等是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中常見的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,也是目前對口腔癌前病損診斷和惡變預(yù)測的主要依據(jù)。由于中心體本身在細(xì)胞的極性、形狀及運(yùn)動方面都起著重要作用,因此,中心體異?？赡茉诳谇簧掀ぎ惓Ｔ錾翱谇击[癌的細(xì)胞形態(tài)學(xué)表型特征改變中起一定作用。本研究中,中心體異常程度與口腔癌前病損及口腔鱗狀