第8章 污染物的毒性與毒性試驗(yàn)

掌握水中毒物的毒性作用及毒性效應(yīng)的概念，主要受試水生生物的毒性試驗(yàn)方法，急性毒性及LC50的求算。初步掌握亞急性毒性、蓄積性毒性及慢性毒性及其實(shí)驗(yàn)方法。了解天然水中污染物的生物蓄積、排出的主要形式及模型。初步了解水中污染物聯(lián)合毒性作用類型評(píng)定。重點(diǎn)難點(diǎn)：水中毒物的毒性作用及毒性效應(yīng)的概念，主要受試水生生物的毒性試驗(yàn)方法，急性毒性及LC50的求算。污染物的毒性與毒性試驗(yàn)污染物的毒性與毒性試驗(yàn)第一節(jié)毒性作用與毒性試驗(yàn)第二節(jié)急性毒性試驗(yàn)第三節(jié)亞急性與慢性毒性試驗(yàn)第四節(jié)聯(lián)合毒性試驗(yàn)第一節(jié)毒性作用與毒性試驗(yàn)

一、毒性作用的一些基本概念毒物：指在一定條件下，較小濃度或劑量就能引起生物機(jī)體功能或器質(zhì)性損傷的化學(xué)物質(zhì)，或劑量雖微，但積累到一定的量，就能干擾或破壞生物機(jī)體正常生理功能引起暫時(shí)或永久性的病理變化，甚至危及生命的化學(xué)物質(zhì)。中毒：生物機(jī)體功能或器質(zhì)性改變后出現(xiàn)疾病狀態(tài)。毒性：一定量的毒物接觸或進(jìn)入生物機(jī)體后，對(duì)生物能夠產(chǎn)生不同程度的損壞。毒物對(duì)生物引起這種損壞的能力稱為毒物的毒性。從毒物上講從生物上講銀汞齊：漁業(yè)上禁用，但現(xiàn)在屢禁不止分為：直接毒性——是指有毒物質(zhì)直接作用于生物或生物活性位點(diǎn)所產(chǎn)生的毒性作用。這是我們通常所說(shuō)的毒性。間接毒性——是指由于化學(xué)、物理和/或生物學(xué)環(huán)境改變的影響，導(dǎo)致化合物對(duì)生物機(jī)體產(chǎn)生毒性作用。如食物生物質(zhì)量和/或數(shù)量的改變或生態(tài)位的改變。按照毒物作用于生物的選擇性分為：非選擇性毒性——對(duì)水生生物眾多的細(xì)胞或組織細(xì)胞膜具有毒性影響的毒性。選擇性毒性——僅對(duì)水生生物一種類型的細(xì)胞或組織產(chǎn)生毒性影響的毒性。第一節(jié)毒性作用與毒性試驗(yàn)

一、毒性作用的一些基本概念一、毒性作用的一些基本概念毒物效應(yīng)：外來(lái)化合物引起生物機(jī)體損害的總稱。毒性效應(yīng)分為可逆效應(yīng)和不可逆效應(yīng)。一般可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過(guò)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)（Recoverystudy）加以區(qū)分，即將染毒生物從含有毒物的介質(zhì)中轉(zhuǎn)移至不含毒物的介質(zhì)中以觀察生物中毒狀態(tài)能否得到恢復(fù)。能夠恢復(fù)的毒性效應(yīng)為可逆效應(yīng)，不能恢復(fù)的毒性效應(yīng)為不可逆效應(yīng)生物反應(yīng)或效應(yīng)百分率10050濃度或劑量概率單位濃度或劑量的對(duì)數(shù)濃度或劑量生物反應(yīng)或效應(yīng)百分率轉(zhuǎn)化作圖方式無(wú)損害作用（Non-adverseeffect）特點(diǎn)：不引起生物機(jī)體形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育和壽命的改變；不引起生物機(jī)體功能容量（Functioncapacity）的降低和對(duì)額外應(yīng)激狀態(tài)代償能力的損害；所引起的生物學(xué)變化一般是可逆的，當(dāng)停止接觸化學(xué)物質(zhì)時(shí)，不能檢出生物機(jī)體維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)能力的降低；不能使生物機(jī)體對(duì)其它環(huán)境因素不利影響的易感性增強(qiáng)。損害作用（Adverseeffect）生物體接觸外來(lái)化合物期間或停止接觸后，機(jī)體維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)能力下降是不可逆的，對(duì)某些環(huán)境因素不利影響的易感性增高，代謝速度降低和酶系的相對(duì)活力發(fā)生異常改變。劑量：指給予生物機(jī)體的或生物機(jī)體接觸的外來(lái)化學(xué)物質(zhì)的數(shù)量。在水生毒理學(xué)中常采用外來(lái)化合物在水中的濃度表示。毒理學(xué)中常用的幾個(gè)劑量概念如下：一、毒性作用的一些基本概念一、毒物作用的一些基本概念致死濃度：在一定時(shí)間內(nèi)生物機(jī)體死亡為標(biāo)準(zhǔn)而確定的水中外來(lái)化合物的濃度。(LC)lethiferous－－lethal絕對(duì)致死濃度：在一定時(shí)間內(nèi)引起所觀察生物個(gè)體全部死亡的水中化合物的最低濃度。(LC100)

半致死濃度：在一定時(shí)間內(nèi)引起所觀察生物群體50%死亡的水中化合物的濃度。(LC50)前標(biāo)明時(shí)間96h多。耐受限度（TL）：在一定時(shí)間內(nèi)所觀察生物群體能存活的水中化合物的濃度和其他環(huán)境條件。常用TLm.有效濃度：在一定時(shí)間內(nèi)引起所觀察生物群體發(fā)生某種反應(yīng)的水中化合物的濃度.LC50＝TLmTL80＝LC20重要喲最大允許濃度(MATC)：對(duì)受試驗(yàn)生物沒(méi)有明顯影響的濃度。NOECくMATCくLOEC安全濃度：對(duì)試驗(yàn)生物全生命周期都無(wú)有害影響的毒物濃度。其結(jié)果由下述公式得到：一、毒物作用的一些基本概念具體試驗(yàn)得出一組數(shù)據(jù)：C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7對(duì)試驗(yàn)生物無(wú)統(tǒng)計(jì)顯著性有害效應(yīng)的毒物最高濃度（最大無(wú)作用濃度NOEC）對(duì)試驗(yàn)生物有統(tǒng)計(jì)顯著性有害效應(yīng)的毒物最低濃度（最小有作用濃度LOEC）CS=CS=[24hLC50]×0.3([24hLC50]/[48hLC50])3([24hLC50]/[48hLC50])2[48hLC50]×0.3CS=[96hLC50]

×f--1

f--1在0.1～0.001之間；有高積累且穩(wěn)定選低值，不穩(wěn)定少殘留選高值。起始致死水平（Incipientlethallevel，ILL）

在一不限定的致死時(shí)間內(nèi)，導(dǎo)致50%試驗(yàn)生物死亡的毒物濃度，或者指有50%試驗(yàn)生物能夠長(zhǎng)期存活下去的毒物濃度閾指數(shù)（Thresholdindex，TI）

指192hLC50與96hLC50之比。即

若TI=1，表明96h后試驗(yàn)生物不再出現(xiàn)死亡;若TI<1，則意味著在96-192h內(nèi)仍有試驗(yàn)生物死亡，說(shuō)明致毒192h尚不能求得致死閾濃度.應(yīng)用系數(shù)（Applicationfactor，AF）和急慢性毒性比（Acute-to-chronictoxicityratio，ACR）半數(shù)致死時(shí)間（LT50）

一、毒物作用的一些基本概念危害性（Hazard）:是指生物機(jī)體暴露在有毒物質(zhì)中后引起中毒的可能性。危險(xiǎn)性（Risk）:是指某種物質(zhì)在具體的暴露條件下，對(duì)生物機(jī)體造成損害的可能性的定量估計(jì)或預(yù)期發(fā)生率，也稱危險(xiǎn)度。毒性作用帶:（Toxiceffectzone）急性毒性作用帶（Acutetoxiczone）亞急性毒性作用帶(Subacutetoxiczone)和慢性毒性作用帶（Chronictoxiczone）生物富集系數(shù)（BCF）:當(dāng)生物從環(huán)境或食物吸收化學(xué)物質(zhì)的速率等于體內(nèi)排出該物質(zhì)的速率時(shí)，體內(nèi)毒物濃度和環(huán)境中該毒物濃度的比值。有公式：fBC=Cb/Ce生物富集：生物從周圍環(huán)境積累化學(xué)物質(zhì)的現(xiàn)象。生物放大：生物通過(guò)食物鏈積累化學(xué)物質(zhì)、毒物隨著營(yíng)養(yǎng)級(jí)的提高而增大的現(xiàn)象一、毒物作用的一些基本概念停留時(shí)間（Residencetime）：有毒化學(xué)物質(zhì)在某一環(huán)境介質(zhì)或生物體內(nèi)滯留的時(shí)間。半衰期（Half-life）：某一環(huán)境體系或生物體內(nèi)有毒化合物濃度降低至其初始濃度一半時(shí)所需的時(shí)間。如環(huán)境中DDT的生物化學(xué)半衰期是15年臨界機(jī)體殘留（Criticalbodyresidue，CBR）：生物暴露于有毒化學(xué)物質(zhì)后，產(chǎn)生不良生物學(xué)反應(yīng)的整個(gè)生物機(jī)體中的毒物濃度致死的機(jī)體負(fù)荷（Lethalbodyburden，LBB）：急性毒性試驗(yàn)中，有關(guān)不同死亡率的生物機(jī)體中毒物的殘留量。毒性分級(jí)：毒性分級(jí)小鼠一次經(jīng)口LD50（mg/kg）小鼠吸入染毒2hLD50（PPm）兔經(jīng)皮LD50（mg/kg）劇毒≤10≤50≤10高毒11—10051—50011—50中等毒101—1000501—500051—500低毒1001—100005001—50000501—5000微毒>10000>50000>5000我國(guó)工業(yè)毒物急性毒性分級(jí)

分級(jí)大鼠經(jīng)口LD50（mg/kg大鼠吸入1hLC50（mg/m3大鼠經(jīng)皮24hLD50（mg/kg魚毒（鯉魚48hTLmⅠ（高毒）<50<2<200<1Ⅱ（中毒）50—5002—10200—10001—10Ⅲ（低毒）>500>10>1000>10我國(guó)農(nóng)藥急性毒性分級(jí)毒性指標(biāo)級(jí)

別Ⅰ劇毒Ⅱ高毒Ⅲ中等毒Ⅳ低毒經(jīng)口LD50（mg/kg<5050—500500—5000>5000吸入LD50（mg/L）<0.20.2—22—20>20經(jīng)皮LD50（mg/kg<200200—20002000—20000>20000對(duì)眼的作用腐蝕、角膜混濁（7天內(nèi)未能恢復(fù)）角膜混濁（7天內(nèi)恢復(fù)）刺激持續(xù)7天無(wú)角膜混濁，刺激在7天內(nèi)恢復(fù)無(wú)刺激對(duì)皮膚的作用腐蝕接觸72小時(shí)，嚴(yán)重刺激接觸72小時(shí)中等刺激接觸72小時(shí)中等或輕度刺激美國(guó)EPA制訂的急性毒性分級(jí)表分

級(jí)魚類達(dá)50％死亡率所需天數(shù)特

點(diǎn)120弱毒性210中等毒性35強(qiáng)毒性4<5特強(qiáng)毒性

大鼠經(jīng)口LD50（mg/kg）大鼠經(jīng)皮LD50（mg/kg）固體液體固體液體Ⅰa極度危害性≤5≤20≤10≤40Ⅰb高度危害性5—5020—20010—10040—400Ⅱ中毒危害性50—500200—2000100—1000400—4000Ⅱ輕度危害性>500＞2000＞1000＞4000WHO對(duì)農(nóng)藥危害性分級(jí)建議標(biāo)準(zhǔn)

水生生物進(jìn)行評(píng)價(jià)體系

二、毒性試驗(yàn)必須預(yù)先考慮（1）實(shí)驗(yàn)方法是否被科學(xué)團(tuán)體接受（2）方法比較經(jīng)濟(jì)易于做到，能被重復(fù)（3）試驗(yàn)報(bào)告需包括毒物范圍內(nèi)的效應(yīng)（4）試驗(yàn)結(jié)果可應(yīng)用于野外的預(yù)測(cè)（5）試驗(yàn)生物及條件具代表性（6）所觀測(cè)選擇的生物效應(yīng)應(yīng)是比較敏感，具代表性。試驗(yàn)分類:容器內(nèi)試驗(yàn)溶液的狀況劃分為下面三種：靜水式試驗(yàn)半流水式試驗(yàn)，24h換水一次流水式試驗(yàn)，裝置復(fù)雜，測(cè)試繁瑣為了測(cè)試化學(xué)物質(zhì)對(duì)生物機(jī)體是否會(huì)引起損害作用而進(jìn)行的一系列試驗(yàn)稱……流水式試驗(yàn)系統(tǒng)示意圖按試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間劃分

1.急性毒性試驗(yàn)

是指在短時(shí)間內(nèi)（通常為48-96h）生物接觸高濃度有毒物質(zhì)時(shí)，被測(cè)試化學(xué)物質(zhì)引起試驗(yàn)生物群體產(chǎn)生一特定百分?jǐn)?shù)有害影響的試驗(yàn)2.

亞急性毒性試驗(yàn)

是指毒物對(duì)生物的作用強(qiáng)度低于急性毒性試驗(yàn)，但又高于慢性毒性試驗(yàn)所用的濃度，在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)（5-90d）進(jìn)行的毒性試驗(yàn)。3.

慢性毒性試驗(yàn)

是指在低毒物濃度下致毒時(shí)間接近或超過(guò)整個(gè)生命周期，甚至幾個(gè)世代的毒性試驗(yàn)。有時(shí)稱為完全生活史生物測(cè)試（Completelife-cyclebioassay）。評(píng)價(jià)化學(xué)物質(zhì)對(duì)水生生物的影響，一般至少選擇3個(gè)不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)上的生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即……受試生物選擇的一般原則1.受試生物選擇范圍初級(jí)水體生產(chǎn)者初級(jí)消費(fèi)者次級(jí)消費(fèi)者按試驗(yàn)生物的種類劃分:（二）受試生物選擇的一般原則2.受試生物選擇的條件：受試生物對(duì)試驗(yàn)毒物或因子具高的敏感性;受試生物分布廣，數(shù)量多，易獲得；受試生物有生態(tài)價(jià)值；受試生物在試驗(yàn)室易培養(yǎng)和繁殖；受試生物已足夠了解；受試生物對(duì)毒物的反應(yīng)易測(cè)定，有方法和技術(shù)；受試生物具經(jīng)濟(jì)價(jià)值或觀賞價(jià)值。二、毒性試驗(yàn)1.微型藻類毒性試驗(yàn)所選藻類有銅綠微囊藻、水華魚腥藻、斜生柵藻、蛋白核小球藻、羊角月牙藻、四尾柵藻、小球藻、小環(huán)藻、菱形藻、針桿藻。

（1）藻類的培養(yǎng):餌料生物培養(yǎng)中常用的藻類培養(yǎng)基,溫度為24±2°,CpH7.5±0.2,光照強(qiáng)度為4000±400lx,12:12或14:10的光暗比（2）試驗(yàn)方法:3d內(nèi)，對(duì)照組藻細(xì)胞濃度至少應(yīng)增加16倍;揮發(fā)性化學(xué)物質(zhì)的揮發(fā)損失量應(yīng)控制在20%以下,96h的生長(zhǎng)抑制率在50%上下均有分布；起始藻液濃度為2×104個(gè)/ml；測(cè)試液的配制---50ml藻液（50ml培養(yǎng)基）50ml一定濃度的受試毒物溶液,隔24h測(cè)定藻細(xì)胞的生長(zhǎng)（3）藻細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定

：（3）藻細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定細(xì)胞計(jì)數(shù)——可直接在顯微鏡下計(jì)數(shù)比色法計(jì)數(shù)葉綠素含量——有熒光法和比色法兩種，在750，664，647和630nm下測(cè)定光密度，而750nm處測(cè)得的光密度值（OD750）用于校正濁度，其它波長(zhǎng)的光密度值必須減去OD750后依下式計(jì)算：OD664、OD647、OD630分別為經(jīng)濁度校正后的光密度值L為測(cè)定池光程，即比色杯厚度，cm（4）數(shù)據(jù)處理生長(zhǎng)曲線面積——生長(zhǎng)曲線以下的面積可按下式計(jì)算：A為生長(zhǎng)曲線面積；t0為試驗(yàn)開(kāi)始后第一次測(cè)定的時(shí)間；tn為試驗(yàn)開(kāi)始后第n次測(cè)定的時(shí)間；N0為在t0時(shí)藻液中的細(xì)胞數(shù)；N1為在t1時(shí)藻液中的細(xì)胞數(shù)；Nn為在tn時(shí)藻液中的細(xì)胞數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制百分率（IA）采用下式計(jì)算：生長(zhǎng)率——生長(zhǎng)率是單位時(shí)間內(nèi)（tn-t1）藻細(xì)胞增長(zhǎng)的量（Nn-N1）。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻類平均特定生長(zhǎng)率（m）可用下式計(jì)算：（1）蚤類的培養(yǎng)

（2）試驗(yàn)方法

試驗(yàn)容器---125ml燒杯或廣口瓶，100ml試驗(yàn)溶液…每個(gè)試驗(yàn)濃度組或?qū)φ战M至少20只幼蚤，分成4組，每組5只試驗(yàn)溫度---范圍為18-22°C試驗(yàn)光照---光強(qiáng)為1200-1600lx試驗(yàn)動(dòng)物的移取---口徑5mm的橡膠頭吸管輕輕吸取水質(zhì)監(jiān)測(cè)---pH為7.8±0.2，硬度250±25mg/L（以CaCO3計(jì)），Ca/Mg比接近4:1，溶解氧濃度為空氣飽和值的80％以上（3）試驗(yàn)觀測(cè)指標(biāo)

存活率、蚤類繁殖、蚤類生長(zhǎng)2.氵蚤類毒性試驗(yàn)：參照<水質(zhì)-----物質(zhì)對(duì)氵蚤類急性毒性測(cè)定方法>(GB/T13266---1991)或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)<水質(zhì)---大型氵蚤運(yùn)動(dòng)抑制的測(cè)定>(ISO---1982)3.魚類毒性試驗(yàn):可參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)<水質(zhì)-----物質(zhì)對(duì)淡水魚(斑馬魚)急性毒性測(cè)定方法>(GB/T13267---1991)或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)<水質(zhì)-----物質(zhì)對(duì)淡水魚(斑馬魚)急性致死毒性的測(cè)定----第一部分:靜水式試驗(yàn)方法>常測(cè)定魚類:青,草魚,鰱,鳙,鯉,鯽,團(tuán)頭魴,麥穗魚,青鳉,羅非魚,馬蘇大馬哈魚,虹鱒（1）試驗(yàn)前準(zhǔn)備

個(gè)體的選擇，受試魚類的馴養(yǎng)至少兩周（2）試驗(yàn)方法

試驗(yàn)容器（魚的大小而定）盛水量以每條魚2~3L；試驗(yàn)溶液配---制試驗(yàn)物質(zhì)儲(chǔ)備液所用試劑至少為分析純；試驗(yàn)條件---冷水魚類12~18℃溫水魚類20~28℃；試驗(yàn)動(dòng)物的移取---30min內(nèi)全部移?。?）試驗(yàn)觀測(cè)指標(biāo)：急性毒性試驗(yàn)——試驗(yàn)開(kāi)始后2、4、6、8、10、12、16、20、24、32、40、48、60、72、96h觀察試驗(yàn)魚的活動(dòng)情況，發(fā)現(xiàn)死亡個(gè)體應(yīng)及時(shí)撈出，并記錄時(shí)間。統(tǒng)計(jì)24、48、72、96h各時(shí)間內(nèi)死亡或異常魚類個(gè)體總數(shù)，計(jì)算死亡率。亞急性和慢性毒性試驗(yàn)——主要是個(gè)體甚至細(xì)胞水平上的結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)，以及種群、群落甚至生態(tài)系統(tǒng)水平上的結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)，尤其是那些反映種群生存和繁榮的生態(tài)學(xué)指標(biāo)。如形態(tài)、組織病變、器官生理功能、個(gè)體生長(zhǎng)、繁殖、食物轉(zhuǎn)換效率、行為、呼吸、酶活力、抗病力、遺傳、對(duì)化合物的易感性以及殘留等。此外，按照試驗(yàn)體系中受試生物物種的數(shù)量，還可分為單物種生物毒性試驗(yàn)，多物種生物毒性試驗(yàn)及模擬生態(tài)系統(tǒng)毒性試驗(yàn)。按照在毒性試驗(yàn)或生物測(cè)試（Bioassay）中受試生物所產(chǎn)生的效應(yīng)，可分為致毒試驗(yàn)、